豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞(OHC)进行了研究,结果表明:(1)新分离的正常OHC呈柱状,胞膜先滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,4小时内形态无明显变化.(2)全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,OHC膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成.(3)利用全细胞记录方式得到的OHC静息电位值为-26±9mV((?)±SD,n=10).     

豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性

本文旨在探讨豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究.应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞对乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)的反应.结果显示,7.5%(21/279)的Ⅰ型前庭毛细胞对10～1000μmol/L ACh敏感,引发明显的外向电流.该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度(EC50)为(63.78±2.31)μmol/L,但该电流为非电压依赖性.在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol/L ACh激活一持久缓慢的外向电流,电流幅值为(170±15)pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断.Ⅰ型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min.长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭.以上结果提示,部分豚鼠Ⅰ型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活一持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性.本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示Ⅰ型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义.     

豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性

本文旨在探讨豚鼠I型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究。应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠I型前庭毛细胞对乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的反应。结果显示,7．5％（21／279）的I型前庭毛细胞对10-1000μmol／L ACh敏感,引发明显的外向电流。该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度（EC50）为（63.78±2．31）μmol／L,但该电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol／L ACh激活-持久缓慢的外向电流,电流幅值为（170±15）pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断。I型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min。长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。以上结果提示,部分豚鼠I型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活-持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性。本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示I型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义。     

豚鼠耳蜗外毛细胞外向钾电流的研究

哺乳动物耳蜗具有超常的敏感性和频率分析能力 ,这依赖于感觉细胞基底膜的微机械反应。豚鼠耳蜗外毛细胞底侧膜存在电压依赖性Ｋ 通道、Ｃａ2 激活Ｋ 通道和内向钙通道等。文献报道牛蛙壶腹嵴毛细胞有瞬息Ｋ 电流 (ＩＡ) ,然而豚鼠耳蜗外毛细胞是否存在ＩＡ,迄今未见报道。来自脑干的内侧橄榄耳蜗束传出神经纤维大量分布于外毛细胞 ,调控着外毛细胞的功能 ,一般认为乙酰胆碱是耳蜗传出神经递质 ,此外三磷酸腺苷 (ＡＴＰ)对外毛细胞具有神经递质和神经调质双重作用 ,那么是否还有其他的递质发挥作用呢 ?我们应用全细胞膜片钳技术观察了豚鼠…     

豚鼠耳蜗外毛细胞的急性分离及钾离子通道的研究

本文对豚鼠耳蜗离体外毛细胞的细胞活性及底侧膜处电压依赖性钾离子通道进行了研究,结果表明：（１）离体外毛细胞悬液保存在４℃时,可延长存活时间达７ｈ以上。（２）外毛细胞的静息电位：应用电流钳方法,在刚形成全细胞方式时其细胞内静息电位为－７３．７±６．９ｍＶ,２ｍｉｎ后为－９４．８±４．１ｍＶ（ｘ±ｓ,ｎ＝１０）。（３）全细胞方式记录到的电压依赖性外向Ｋ＋电流是由快钾电流和延迟整流钾电流两部分组成,快钾电流的激活电位为－６０～－５０ｍＶ,延迟整流钾电流的激活电位为－４０～－３０ｍＶ,电流－电压关系曲线呈“Ｓ形上升”趋势。外向Ｋ＋电流被ＴＥＡ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）阻断后,可观察到一种电压依赖性内向电流     

利诺吡啶对豚鼠耳蜗外毛细胞和Deiters细胞钾电流的抑制

为探讨KCNQ家族钾通道在耳蜗外毛细胞和Deiters细胞的功能性表达,我们观察并记录了KCNQ家族钾通道阻滞剂利诺吡啶对豚鼠耳蜗单离外毛细胞(outer hair cells,OHCs)和Deiters细胞总钾电流的影响。采用酶孵育加机械分离法分离豚鼠耳蜗单个OHCs和Deiters细胞：运用膜片钳技术,在全细胞模式下记录正常细胞外液中8个外毛细胞和5个Deiters细胞的总钾电流,并观察100μmol／L和200μmol／L利诺吡啶对外毛细胞和Deiters细胞总钾电流的影响。结果观察到,在正常细胞外液中的单离外毛细胞,可记录到四乙基二乙胺敏感的外向性钾电流和静息膜电位附近激活的内向性钾电流(the K^ current activated at negative potential,IKa)两种钾电流,而在单离Deiters细胞中只记录到外向整流性钾电流。在细胞外液中,加入100μmol／L利诺吡啶后,OHCs中的四乙基二乙胺敏感的钾电流峰电流成分被抑制,稳态电流幅值减小,且电流的失活时问常数明显延长;在细胞外液中加入100μmol／L和200μmol／L利诺吡啶后,OHCs的内向性钾电流IKa被完全抑制;而细胞外液中利诺吡啶终浓度为200μmol／L时,Deiters细胞的外向整流性钾电流幅值无明显变化。由此我们推测,KCNQ家族钾通道存在于豚鼠耳蜗外毛细胞,其介导的钾电流是四乙基二乙胺敏感的钾电流的组成部分,并构成全部的IKn,其功能是介导细胞内K^ 外流和防止细胞过度去极化;KCNQ家族钾通道不存在于豚鼠耳蜗Dciters细胞。     

豚鼠耳蜗离体外毛细胞的膜电位和离子电流

利用膜片钳技术对分离的豚鼠耳蜗外毛细胞进行了研究,结果表明：（１）新分离的正常ＯＨＣ呈术状,胞膜光滑,胞核位于底部,静纤毛由顶端表皮板伸出,４小时内形态无明显变化。（２）全细胞电压钳记录结合通道阻断剂实验表明,ＯＨＣ膜电流主要由电压依赖性钾离子流组成。（３）利用全细胞记录方式得到的ＯＨＣ静息电位值为－２６±９ｍＶ．     

豚鼠耳蜗内毛细胞、外毛细胞及外指细胞钙成像

用ｆｌｕｏ－３／ｆｕｒａ－ｒｅｄ荧光比值作细胞内游离钙指标,用激光扫描共聚焦显微镜测定豚鼠耳蜗分离的内、外毛细胞及外指细胞的游离钙,并利用钙成像技术进行细胞形态计量。单个外毛细胞呈试管状。内毛细胞呈烧瓶状,有明显的颈部。外指细胞分为体部及指状突部。毛细胞的胞内游离钙浓度明显高于外指细胞。毛细胞的胞质、胞核及表皮板的游离钙浓度不同。外指细胞的细胞体与指状突的游离钙浓度也不同。本研究认为,有无颈部为区别分离的内、外毛细胞的重要标准,外指细胞可凭借其特异的指状突结构以资识别。内耳毛细胞及外指细胞胞内游离钙分布的不均一性可能与各部位生理功能不同有关。     

阳离子对豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性电流的调制

本文旨在探讨哺乳动物前庭胆碱能传出神经系统的作用机制,应用全细胞膜片钳技术研究新鲜分离的豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性电流的特性以及细胞内外的阳离子对ACh-敏感性电流的调制作用。结果显示,Ⅱ型前庭毛细胞对细胞外ACh敏感,ACh激活缓慢持久的外向性电流,室温下此电流的再次完全激活时间约为(60±10)s。ACh-敏感性电流的反转电位为(-66±8)mV,提示此电流主要由K+参与形成,其直接作用是使毛细胞超极化。ACh-敏感性电流对较高浓度的四乙胺(tetraethylammonium chloride,TEA)敏感,提示细胞外ACh激活钙依赖性钾电流。进一步检测细胞内外阳离子对 ACh-敏感性电流的调制作用发现,细胞外Na+和细胞内Ca2+释放不参与此电流的激活过程,而细胞外K+、细胞外Ca2+和细胞内Mg2+对ACh-敏感性电流具有重要的调制作用。进一步提示,ACh是哺乳动物前庭传出神经系统重要的神经递质。 Na+不参与ACh-敏感性电流的激活过程提示,ACh-敏感性电流可能由非α9-N型胆碱能受体(α9-nAChR)介导。ACh诱导的Ⅱ型前庭毛细胞超极化作用受细胞外Ca2+浓度和细胞内Mg2+浓度调制。     

川芎嗪抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞钾通道的影响

本文旨在研究川芎嗪（tetramethylpyrazine,TMP）拮抗链霉素耳毒性作用及其对豚鼠耳蜗外毛细胞K^＋通道的影响,探讨TMP拈抗链霉素耳毒性的离子通道机制。60只豚鼠随机分为6组,应用听觉脑干反应（auditory brainstem response,ABR）技术检测豚鼠ABR听阈,观测TMP的抗链霉素耳毒作用;并采用全细胞膜片钳技术观察TMP对耳蜗外毛细胞Ca^2＋敏感艮电流的影响。结果显示,TMP明显降低链霉素导致的豚鼠ABR听阈升高,提示TMP具有抗链霉素耳毒性作用;TMP能明显增大豚鼠耳蜗外毛细胞Ca^2＋敏感艮电流,并呈浓度依赖关系。结果提示,TMP通过增大艮通道电导而拮抗链霉素耳毒性作用。     

耐钙心肌细胞的分离和电生理特性观察

用快速、恒压的无钙和胶原酶Ｔｙｒｏｄｅ液相继灌流豚鼠心脏冠脉系统后,再经无钙液室温浸泡心脏和用改变的Ｋ－Ｂ液帮助分离细胞的恢复,可获得耐钙的游离心肌细胞。全细胞电流记录：静息电位为－７２±９ｍＶ（ｎ＝１２）,并显示出快内向电流（ＩＮａ）,可被异搏定阻断的慢钙离子流和时间依赖性外向钾流（Ｉｋ）;单通道记录分别显示了Ｎａ＋Ｃａ２＋和Ｋ＋通道的电压依赖性等特征。结果表明了用此法分离的细胞具有耐钙性和正常电生理特性。     

尿激酶型纤溶酶原激活物的表达与毛囊细胞增殖关系的研究

为了研究毛囊外根鞘(outer root sheath,ORS)细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasmino-gen activator,uPA)的表达与其细胞周期的关系,并探讨uPA对毛囊生长的调控作用,本文应用流式细胞仪对不同代龄的ORS细胞的细胞周期进行了 检测,并用免疫细胞化学和RT-PCR手段对相应代龄ORS细胞的uPA mRNA及蛋白质的表达进行了检测。结果显示,原代ORS细胞增殖旺盛,而3代ORS细胞增殖水平显著下降,增殖旺盛的ORS细胞uPA mRNA及蛋白表达较强,而增殖缓慢的ORS细胞uPA mRNA及蛋白的表达明显下降或不表达。说明ORS细胞的增殖水平与其uPA mRNA及蛋白的表达密切相关,uPA在毛囊生长早期的表达可以促进毛囊细胞增殖,利于毛囊发育。     

小脑皮质神经元K^＋单通道电流的生理特性

用膜片钳技术的细胞贴附式和内面向外式,在分离培养的新生大鼠小脑皮质颗粒细胞膜上记录到钾离子通道电流,有以下的生理特性,最常见的通道电导为２５ｐＳ,单通道电流幅度、开放时间、开放概率均受膜电位控制,通道开放时间分布直方图可用双指数拟合,无时间依赖性失活,不依赖钙离子,能被ＴＥＡ阻断,表明此通道可能为延迟整流型Ｋ＋通道。提示,小脑皮质颗粒细胞存在有不失活的２５ｐＳ钾离子通道,不同于文献报道的,可能是一种新亚型的钾离子通道。     

C6神经胶质瘤细胞的电压依赖性钾电流

本文全细胞膜片箝方法对大鼠传代培养Ｃ６神经胶质瘤细胞的电压依赖性Ｋ＾＋电流进行了研究。     

THE EFFECTS OF TETRAPHENYLBORON ON THE ISOLATION OF NEURONAL AND GLIAL CELLS FROM GUINEA-PIG BRAIN

Abstract— The addition of 20 mM-tetraphenylboron to the tissue-softening medium of a neuronal and glial cell isolation procedure results in a 2-fold and 5-fold increase in the yield of neuronal and glial-enriched material respectively. The purity of the isolated fractions appears unaltered. While tetraphenylboron strongly inhibits protein synthesis, carbonic anhydrase activity and structural integrity appear unaffected by tetraphenylboron. The potential use of this compound in cell isolations is discussed.     

构树钟乳体毛的发育及钟乳体成分研究

构树(Broussonetis Papyrifea)幼茎、芽,叶的表面具钟乳体毛。它是一长圆锥状单细胞毛,基部有无管漏斗状基座包裹,腔内有呈轮纹状沉积的钟乳体。钟乳体毛发生很早,自芽的第3幼叶(自叶原基数起)开始发生。原表皮细胞进行不均等的垂周分裂,其小的发育成表皮细胞,大的发育成钟乳体毛。基座由原表皮细胞垂周及横分裂而形成。其内钟乳体发育较迟,要等叶长至6cm,宽4—5cm时,才从毛尖或毛尖之下侧壁处开始沉积。构树钟乳体成分中含硫酸钙,这可能正是构树积累硫的速度快,净化大气中有害的SO_2气体和可能抗SO_2污染很强的原因。对筛选和培育抗SO_2毒气更强的植物提供了参考。     

声损伤后鸡听觉上皮的修复和毛细胞再生──扫描电镜与图像分析研究

应用扫描电镜和图像分析方法对宽带噪声损伤后鸡基底乳头病变以及听觉毛细胞再生反应进行定量研究。观察了存活０、２、７、１５和３０天时平均毛细胞表面积,平均毛细胞密度,毛细胞／支持细胞面积比及基底乳头损伤范围等参数。结果显示,基底乳头病变范围为近端１０％至中段６０％。早期反应包括支持细胞扩张和毛细胞静纤毛变性及皮板表面积缩小。损伤后２天可见新生毛细胞,形态与胚胎期幼稚毛细胞相似。７～１５天毛细胞数目与表面积逐渐增加,基底乳头ｍｏｓａｉｃ构型基本恢复。静纤毛排列与极性至３０天时尚未完全恢复。损伤区仍有散在的残存毛细胞及分化早期的幼稚毛细胞。上述结果提示,再生毛细胞的前体存在于受损区局部并与支持细胞的活动有关。前体细胞的增殖至再生毛细胞出现的时间约为４８ｈ,但亦存在一定程度的非同步现象,损伤后７～１５天为细胞修复的主要时期。     

大鼠海马CA1区锥体细胞的急性分离和鉴定

目的：建立一种适用膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法,并对其进行鉴定。方法：采用酶加机械分离法制备７～１０ｄ鼠龄的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞,用免疫荧光技术鉴定神经元,其电生理学特性测定用全细胞膜片钳技术。结果：分离的锥体细胞是海马ＣＡ１区锥体细胞,且具有正常的电生理学特性,并保存了某些主要的电压依赖性和受体依赖性离子通道特性。结论：成功地建立了一种简单、快速、高产的适用于膜片钳技术的大鼠海马ＣＡ１区锥体细胞的急性分离方法。