EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）的致瘤机制,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF－κB机制进行了研究,首先,采用免疫共沉淀－蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2－LMP1中证实LMP1与TRAF1,2,3结合形成免疫共沉淀复合物,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1（野生型, wt),HNE2－LMP1 del187-351(CTAR1缺失型）,HNE2－LMP1（1－231）,（CTAR2缺失型）,HNE2－LMP1（1－187）（羰基端胞浆区缺失型）,HNE2－pSG5(空白载体型）为材料,结合NF－κB报道基因质粒（pG12-NF-B-luc)的荧光素酶活性表达分析NF－κB的活性,证实：较之母细胞,野生型LMP1活化NF－B达13．8倍,LMP1（1－187）几乎不活化NF－kb,LMP1(1-231)活化NF－kB 达4．9倍,LMP1（del187-351)活化NFκB达9．1倍,TRAF1过表达升高LMP1（ wt)及LMP1（1－231）介导的NF－κB活性,而对LMP1（del187-351)活化NFκB无影响,TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑,制LMP1（wt)及LMP1（1－231）介导的NF－κB活性而不影响LMP1（del187－351）活化NF－κB,TRAF2过表达升高LMP1（wt),LMP1(1-231)及LMP1（del 187-351)介导的NF－kB活性,这些结果表明：鼻咽癌中LMP1通过TRAF1,TRAF2或TRAF3调控NF－kB,TRAF1和TRAF3主要通过CTAR1发挥作用,TRAF2的作用主要是通过CTAR1和CTAR2介导的。     

EB病毒潜伏膜蛋白1通过结合TRAFs调控NF-κB

为了探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)的致瘤机制,对鼻咽癌中LMP1激活重要的核转录因子NF-κB机制进行了研究.首先,采用免疫共沉淀-蛋白质印迹在稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE2-LMP1中证实LMP1与TRAF1,2,3结合形成免疫共沉淀复合物,进一步以野生型LMP1及其三种突变体的鼻咽癌细胞系LMP1（野生型,wt）、HNE2-LMP1 del187～351(CTAR1缺失型)、HNE2-LMP1(1～231)(CTAR2缺失型)、HNE2-LMP1(1～187)(羧基端胞浆区缺失型)、HNE2-pSG5(空白载体型)为材料,结合NF-κB报道基因质粒（pGL2-NF-κB-luc）的荧光素酶活性表达分析NF-κB的活性,证实:较之母细胞, 野生型LMP1活化NF-κB达13.8倍, LMP1(1～187)几乎不活化NF-κB,LMP1(1～231)活化NF-κB达4.9倍, LMP1(del187～351)活化NF-κB达9.1倍;TRAF1过表达升高LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而对LMP1(del 187～351)活化NF-κB无影响;TRAF3过表达或TRAF3负显性突变体抑制LMP1(wt)及LMP1(1～231)介导的NF-κB活性,而不影响LMP1(del 187～351)活化NF-κB; TRAF2过表达升高LMP1(wt)、LMP1 (1～231)及LMP1(del 187～351)介导的NF-κB活性.这些结果表明：鼻咽癌中LMP1通过TRAF1、TRAF2或TRAF3调控NF-κB,TRAF1和TRAF3主要通过CTAR1发挥作用,TRAF2的作用主要是通过CTAR1和CTAR2介导的.     

EB病毒潜伏膜蛋白1通过TRAF/TRADD激活JNK信号途径

为了探讨在鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)激活c-Jun氨基端激酶(JNK)信号途径的分子机制,利用可调控表达LMP1的鼻咽癌细胞系L7,蛋白质印迹检测,发现LMP1能够促进JNK的活化;利用稳定表达LMP1的鼻咽癌细胞系HNE₂-LMP1及其三种突变体HNE₂-LMP1ΔCTAR1、HNE₂-LMP1ΔCTAR2、HNE₂-LMP1ΔCTAR1,2及LMP1阴性的HNE₂为材料,采用蛋白质印迹和报告基因法分析JNK和活化蛋白1(AP1)活化情况,结果显示HNE₂-LMP1和HNE₂-LMP1ΔCTAR1中磷酸化JNK蛋白表达量和AP1活性都无显著差异,而与HNE₂-LMP1ΔCTAR2、HNE₂-LMP1ΔCTAR1,2、阴性对照HNE2及空白载体转染细胞的JNK蛋白表达和AP1活性具有显著差异;进一步比较转染TRAF、TRADD显性负性突变体鼻咽癌细胞系HNE₂-LMP1中磷酸化的JNK量和AP1活性,结果显示：TRAF-DN和TRADD-DN的导入使活化的JNK蛋白和AP-1活性显著降低,二者间无显著差异,提示TRAF和TRADD可能参与了LMP1对JNK和AP-1的活化.以上结果提示在鼻咽癌细胞系中LMP1功能结构域CTAR2通过结合TRAF/TRADD激活JNK从而活化重要的转录因子AP1.     

GCG干预LMP1激活的NF-κB信号转导通路中的靶分子

为阐明在鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞中茶多酚干预EB病毒潜伏膜蛋白 1(latentmembraneprotein 1,LMP1)激活的NF κB信号转导通路中的靶分子 ,采用EBV阴性及阳性的鼻咽癌细胞系CNE1和CNE1 LMP1细胞 ,利用噻唑蓝 (MTT)法 ,观察表没食子儿茶素没食子酸酯 (EGCG)对CNE1和CNE1 LMP1细胞生存率的影响 .采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对NF κB活性的作用 .利用间接免疫荧光法 ,观察EGCG对NF κB (p6 5 )核移位的影响 ,再分别提取CNE1和CNE1 LMP1的胞浆及胞核蛋白 ,通过蛋白质印迹分析EGCG抑制NF κB (p6 5 )的核移位后胞浆及胞核蛋白中NF κB (p6 5 )的变化 .采用蛋白质印迹分析EGCG对IκBα的磷酸化水平的影响 .采用瞬间转染及报道基因法观察EGCG对EGFR启动子活性的影响 ,并用蛋白质印迹分析EGCG对EGFR自身磷酸化的作用 .结果表明EGCG对鼻咽癌细胞的抑制作用有剂量依赖性 ,并可抑制NF κB的活性 .EGCG能抑制NF κB (p6 5 )的核移位 ,并抑制IκBα的磷酸化 .EGCG对NF κB信号通路下游的靶基因EGFR的启动子活性及自身磷酸化都有抑制作用 .由上述结果可以推断 ,EGCG对信号转导通路上的NF κB、NF κB (p6 5 )、IκBα、EGFR多个靶点分子具有干预作用 .LMP1是EB病毒编码的蛋白质 ,因此 ,EGCG抑制     

Epstein-Barr病毒潜伏性膜蛋白1 CTAR3缺失突变体的构建与功能分析

[目的]探讨Epstein-Barr病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促细胞转化的主要活性部位及其作用机制.[方法]采用PCR方法重组LMP1羧基末端活化域3(aa232-aa351)对应密码子缺失突变体(LMP1△232-351),将突变型LMP1△232-351和野生型LMP1(LMP1WT)分别导入永生化的鼻咽上皮细胞NP69中,比较二者对细胞的转化作用.同时,构建含JAK3启动子序列的荧光素酶表达质粒(pGL-2/JAK3-LUC),将LMP1△232-351与LMP1WT分别与含有JAK3启动子序列或NF-kB结合序列启动子的荧光酶表达质粒共转染293细胞(用pLNSX质粒作对照),比较二者活化JAK3启动子或转录因子NF-KB的功能.[结果](1)LMP1△232-351促NP69细胞转化的能力较LMP1WT显著降低(n=3,p<0.01).(2)LMP1WT能明显呈浓度依赖陛活化JAK3启动子,而LMP1△232-351上调能力几乎丧失.[结论]LMP1羧基末端活化域3(aa232-aa351)是LMP1的重要活性部位之一,其促细胞转化的作用与JAK3蛋白表达调节有关.     

EB病毒LMP-1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP-1活化

 EB病毒潜伏膜蛋白 1 (latentmembraneprotein 1 ,LMP 1 )活化激活蛋白 1 (activatorprotein 1 ,AP 1 )信号传导途径与其致瘤作用密切相关 .为了探讨LMP 1活化AP 1信号传导的分子机制 ,在可诱导调控LMP 1表达的鼻咽癌细胞系L7中 ,首先通过荧光酶双报道系统确定了LMP 1表达能激活AP 1 ;在此基础上 ,用c JunPathDetect系统确定LMP 1表达活化AP 1是通过c Jun的磷酸化 (活化 )介导 .虽然LMP 1不能上调c Jun上游主要调节激酶c JunN端激酶 (c JunN terminalkinase ,JNK)的蛋白表达 ,但能显著促进JNK的磷酸化 (活化 ) ;在L7细胞中导入JNK相互作用蛋白 (JNK interactingprotein ,JIP)基因 ,抑制JNK的核移位能显著抑制LMP 1诱导的AP 1活化 ,同时对NFкВ活化也有部分抑制作用 .结果表明 ,EB病毒LMP 1在鼻咽癌细胞中通过JNK介导AP 1活化     

EB病毒编码的潜伏膜蛋白1参与鼻咽癌恶性演进的转录调控实验研究

探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)激活激活蛋白1(AP1),和核转录因子(NF-κB)在鼻咽癌细胞SUNE-1及亚细胞株恶性演进中的作用.运用报告基因法和凝胶电泳迁移率法(EMSA)分析AP1和NF-κB反式激活活性和DNA结合活性,蛋白质印迹检测蛋白质表达;裸鼠致瘤实验结合组织制片研究瘤细胞的成瘤和转移能力. 结果显示恶性程度不同的SUNE-1亚细胞株的反式激活活性、DNA结合活性、LMP1蛋白表达及c-Jun氨基端激酶(JNK)活性均存在明显差异,且与细胞恶性程度正相关.这些结果提示LMP1活化AP1和NF-κB的信号通路参与了鼻咽癌细胞SUNE-1的恶性演进过程.     

鼻咽癌细胞中EB病毒编码的潜伏膜蛋白1活化cyclinD1的表达

为了探讨EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(EBV-LMP1)促进细胞增殖,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制,研究了LMP1在鼻咽癌细胞中调节cyclinD1表达,进而影响细胞周期行进及细胞恶性表型改变,并初步确定了LMP1发挥该功能的结构域.利用已建株的Tet-on-LMP1-HNE2鼻咽癌细胞系,蛋白质印迹实验分析LMP1诱导cyclinD1蛋白质表达的表达动力学,包括时间效应及剂量效应;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照,确定LMP1活化cyclinD1表达的结构域.同时结合基因诱导表达及反义寡聚核酸技术阻断基因表达的实验方法,进一步确定LMP1上调的cyclinD1功能,即对细胞周期行进及细胞恶性表型的影响.结果表明LMP1确实可以诱导cyclinD1的表达（2～4倍）,且诱导具有时间依赖性及剂量依赖性;利用三种LMP1功能区缺失的突变体及野生型LMP1,以载体型细胞为对照,结合报道基因分析法,确定与空白载体细胞系比较,野生型LMP1从转录水平可反式激活cyclinD1报道基因活性约11.2倍,其中CTAR1及CTAR2均可活化cyclinD1表达,但以CTAR2为主,与野生型LMP1诱导cyclinD1反式激活活性比较,CTAR1缺失导致cyclinD1报道基因活性下降23.6%,CTAR2缺失导致cyclinD1活性下降约80.7%,C端均缺失时cyclinD1活性只有野生型的17.7%.流式细胞仪分析显示,强力霉素诱导后cyclinD1高表达的细胞停留于G0/G1期明显减少,较未经诱导的细胞,从66.42%减至56.55%,而进入S期及G2/M期的细胞明显增多.在稳定表达LMP1的细胞中,与导入正义LMP1比较,导入反义LMP1 PS-ODNs及反义cylinD1,可以使细胞软琼脂集落形成率明显降低(从30.48%分别降至15.21%,21.76%).EBV-LMP1可以活化cyclinD1的表达,且发挥这种功能的结构域以CTAR2为主,活化的cyclinD1参与细胞周期行进,抑制LMP1及cyclinD1的表达均可导致细胞软琼脂集落形成率降低.     

A20基因转导抑制异种移植中猪内皮细胞的活化

延缓性排斥反应 (DXR)是进行异种器官移植亟待解决的问题之一 .在DXR过程中 ,核心事件是异种移植物血管内皮细胞的活化 .核转录因子 (NF κB)在这一过程中起着重要的作用 .A2 0是一个具有锌指结构的蛋白 ,它可以抑制以NF κB为核心的信号转导系统 .向猪血管内皮细胞(PAEC)中导入A2 0基因 ,经RT PCR检测 ,A2 0基因能在细胞中稳定表达 .细胞生长曲线分析表明 ,A2 0的基因转导并不影响细胞的正常生长 ;电泳迁移率变动分析 (EMSA)表明 ,A2 0基因能抑制由肿瘤坏死因子 α(TNF α)诱导的NF κB的激活 ;流式细胞术分析表明 ,A2 0基因对受NF κB调控的一个重要炎症因子———E选择素的表达抑制率达 77 2 % .A2 0基因转导可能成为克服异种移植过程中DXR的手段之一 .     

Epstein-Barr病毒潜伏蛋白1通过核转录因子κB诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性

利用已建立的原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet-on-LMP1系统等良好的实验模型,采用荧光酶报道基因分析法和端粒酶TRAP-ELISA技术,分别检测EB病毒潜伏蛋白1(LMP1)诱导的核转录因子κB(NFκB)活性和端粒酶活性,从LMP1介导NFκB信号传导途径角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制.结果表明,LMP1可诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性,将LMP1羧基端胞浆区突变后,可同时下调NFκB活性和端粒酶活性.在Doxycycline诱导LMP1表达状态下,NFκB反式激活活性增强,同时端粒酶活性升高;进一步应用硫代磷酸化修饰的反义NFκB p65寡脱氧核苷酸和IκBα的显性负性突变体分别阻断NFκB活性,可降低由LMP1诱导的端粒酶活性.因此,NFκB作为LMP1信号传导途径上的枢纽,可能介导了LMP1对端粒酶的表达调控.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism