基于16S rRNA高通量测序技术分析福州地区慢传输型便秘患者肠道菌群的变化

运用16S rRNA高通量测序技术分析福州地区慢传输型便秘(STC)患者肠道菌群变化的特征。

纳入60例STC患者和健康志愿者20例, 留取新鲜粪便样本, 冰块运送至实验室并存放于-80度冰箱, 应用16S rRNA高通量测序技术, 分析各组肠道菌群的生物多样性与结构组成。

测序后共得到1 702 004 524条有效序列, 样本序列平均有效长度为414.1 bp, 总样本平均序列条数为2 127 505.7条。与对照组比较, STC患者肠道菌群丰度指数Ace指数、Chao指数和肠道菌群多样性指数Shannon指数下降(P < 0.05), 肠道菌群多样性指数Simpson指数显著升高(P < 0.05)。在门水平上, STC组以拟杆菌门、放线菌门为主, 正常对照组以厚壁菌门为主。在属水平上, STC组以拟杆菌属(Bacteroides)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、丹毒杆菌属(Erysipelatoclostridium)、巨单胞菌属(Megamonas)为主, 正常对照组以乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、布劳特菌属(Blautia)为主。

STC患者肠道菌群发生紊乱, 表现为丰度及多样性下降, 菌群结构发生改变, 可能与慢传输型便秘的发生发展有关。

     

不同程度颅脑疾病患者肠道菌群分析

检测不同程度颅脑疾病患者肠道菌群分布情况, 探讨患者肠道菌群分布与疾病的关系, 为该类患者的治疗提供参考。

通过MiSeq PE2x300 bp高通量测序技术对21例重度颅脑损伤患者(G1组, GCS≤8分)和14例轻度颅脑损伤患者(G2组, GCS > 8分)粪便样本中细菌的16S rRNA基因V3-V4可变区进行定性分析, 并对两组患者肠道菌群进行生物学分类比较、多样性分析和组间物种差异分析。

两组患者肠道菌群多样性差异无统计学意义(均P > 0.05)。G1组患者肠道厌氧球菌属(Anaerococcus)、埃希菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)数量高于G2组(均P < 0.05)。

颅脑疾病患者肠道菌群紊乱, 其肠道菌群丰度及多样性显著下降, 有害菌数量升高, 有益菌数量下降。

     

急性脑卒中患者肠道菌群研究

通过粪便标本检测急性脑卒中患者肠道菌群变化情况, 探讨急性脑卒中患者肠道菌群结构。

通过高通量二代测序技术对10例健康者(对照组)及10例急性脑卒中患者(疾病组)粪便样本进行菌群结构测序分析。

与对照组比较, 急性脑卒中患者粪便样本中物种OTU信息量显著增加(P < 0.01), 菌群多样性指数(Shannon)和物种均一度指数(Evenness)也有所增加但差异无统计学意义(均P > 0.05)。门水平上, 疾病组患者肠道Bacteroidetes数量较对照组显著增加, Firmicutes数量显著减少(均P < 0.05)。属水平上, 疾病组患者肠道Bacteroides、Bilophila、Butyricimonas比例较对照组显著升高, 而Collinsella、Coprococcus、Clostridium等比例较对照组显著降低(均P < 0.05)。

急性脑卒中患者肠道菌群结构与健康人存在显著差异。

     

不同分期的慢性阻塞性肺疾病患者肠道微生态的变化

探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)不同分期肠道微生态的菌群多样性及丰度变化。

本研究为前瞻性病例对照研究。纳入COPD急性加重期患者(A组)、COPD稳定期患者(S组)以及正常对照者(N组)各30例。收集3组研究对象临床资料, 留取粪便标本, 通过16S V3-V4区引物进行细菌多样性鉴定, 对序列进行可操作分类单元(OTU)聚类和物种注释, 分析3组研究对象肠道菌群结构、丰度以及多样性变化。

完成研究且标本合格者80例, 其中A组29例、S组29例、N组22例。比较3组研究对象肠道菌群组内多样性指标(Alpha多样性)和组间多样性指标(Beta多样性), 均提示差异有统计学意义(均P < 0.01)。3组研究对象肠道菌群结构发生改变, 在门水平, 厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、软壁菌门、变形菌门和梭杆菌门差异有统计学意义(均P < 0.01);在属水平, 29种菌属差异有统计学意义(均P < 0.05)。进一步采用线性判别分析效应量(LEfSe分析)找出3组的差异菌。

与正常对照相比, COPD急性加重期及稳定期肠道菌群多样性均有下降, 而急性加重期下降更显著; 3组研究对象肠道菌群结构差异显著, 菌群结构改变可能与急性加重有关。

     

肠道微生物与首发抑郁症的关系分析

分析肠道微生物与首发抑郁症的关系。

选取本院92例首发抑郁症患者纳入抑郁症组, 并取同期年龄、性别构成等匹配体检健康者50例作为对照组, 评估其24项汉密尔顿抑郁量表(HAMD-24)评分, 并于量表评估完成24 h内进行新鲜粪便的收集, 以PCR法定性分析16S rRNA V3-V4可变区, 并采用Pearson法分析菌群与HAMD-24评分的相关性。

两组菌群多样性指数(Ace、Chao、Shannon、Simpson)比较差异无统计学意义(P > 0.05);主坐标分析(PCoA)显示两组肠道微生物群落构成有差异。LEfSe结果显示, 首发抑郁症患者以拟杆菌门、β-变形菌纲、产碱菌科、幽门螺杆菌和伯克菌目等肠道微生物为主; 对照组优势菌主要包括厚壁菌门、乳酸杆菌目和双歧杆菌科等。抑郁症组厚壁菌门、放线菌门、柔壁菌门、Ruminococcus、Subdoligranulum、Enterobacter、Coprococcus、Bifidobacterium、Lactobacillus丰度明显低于对照组(P < 0.05), 拟杆菌门、Klebsiella、Flavonifractor、Bacteroides丰度明显高于对照组(P < 0.05)。HAMD-24评分与拟杆菌门、Flavonifractor、Bacteroides呈正相关(P < 0.05), 与厚壁菌门、放线菌门、柔壁菌门、Ruminococcus、Subdoligranulum、Coprococcus、Lactobacillus呈负相关(P < 0.05)。

首发抑郁症患者肠道微生物α-多样性与正常人相似, 但β-多样性与菌群丰度发生了异常改变, 这些改变和首发抑郁症病情密切相关。

     

IgE介导牛乳蛋白过敏婴幼儿肠道菌群改变初探

应用高通量测序技术探讨IgE介导的牛乳蛋白过敏(cow′s milk protein allergy, CMA)婴幼儿肠道菌群结构和组成的变化。

回顾性分析2012年6月-2013年6月入组食物过敏患儿, 选择出IgE介导的CMA(IgE-CMA)患儿4例, 非IgE介导的CMA(non-IgE-CMA)患儿4例, 采集粪便样本进行454焦磷酸测序分析, 血清样本进行细胞因子检测。

与non-IgE-CMA患儿相比较, IgE-CMA患儿肠道菌群多样性Shannon指数(t=-2.996, P=0.010)和Simpson指数(t=-1.786, P=0.036)显著改变, 菌群多样性下降, 菌群丰富度指数ACE(t=0.406, P=0.021)显著升高。β-多样性PCA分析可显著区分两组, 提示IgE-CMA患儿肠道菌群发生显著改变。LEfSe组成差异分析发现肠道菌群中硬壁菌门和拟杆菌门的改变与CMA的不同表型无关, IgE-CMA婴儿中链球菌、肠球菌、鞘氨醇单胞菌、双歧杆菌、罗思氏菌属、红球菌和梭菌属第Ⅺ簇等减少, 而厌氧杆菌和狭义梭菌属增加, 可用于鉴别诊断CMA表型。

IgE可决定CMA患儿肠道菌群的改变, 这为开展以肠道菌群为靶点的不同表型CMA诊疗提供了新策略。

     

首发抑郁症患者肠道菌群特征及其与健康人群肠道菌群结构的差异

比较首发抑郁症患者与健康人群肠道菌群的差异,探讨抑郁症患者肠道菌群和抑郁症状间的关系,为抑郁症的发病机制研究及治疗提供一定的理论依据。

选择2019年10月至2020年9月我院收治的首发抑郁症患者及健康人群为研究对象,分为抑郁组（n = 23）和健康组（n = 31）。对研究对象肠道菌群16S rRNA基因中V4−V5区域片段进行基因测序,使用汉密尔顿抑郁量表对两组对象抑郁症状进行评估。检测两组对象肠道菌群α多样性、β多样性和组间差异。

首发抑郁症患者与健康人群肠道菌群多样性差异无统计学意义（均P＞0.05）。两组对象肠道拟杆菌门和拟杆菌纲的相对丰度差异有统计学意义（均P＜0.05）。两组对象芽胞杆菌目等的相对丰度差异有统计学意义（P＜0.05）。在属水平和种水平上,两组对象分别有28个菌属和40个菌种的丰度差异有统计学意义（均P＜0.05）。LEfSe分析显示,拟杆菌科、艾克曼菌科等10种菌科是造成两组对象肠道菌群差异的主要细菌。

首发抑郁症患者与健康人群肠道菌群多样性未发现显著差异,但抑郁症患者肠道菌群结构与健康人群相比发生了改变,主要体现在拟杆菌属等细菌在抑郁症患者肠道中的相对丰度显著上升。

     

原发性干燥综合征患者肠道菌群特征分析

通过比较原发性干燥综合征(pSS)患者和健康人群肠道菌群的差异, 深入探讨pSS患者肠道菌群与pSS发生发展的关系。

招募2019年1月至2021年2月于大连市中心医院风湿免疫科住院的pSS患者60名, 作为本研究的pSS组; 同时招募大连市中心医院体检中心的健康志愿者50名作为本研究的对照组(Control组)。收集两组粪便标本, 各50例, 提取细菌DNA进行16S rDNA高通量测序后进行菌群多样性和LEfSe分析。

pSS组肠道菌群α-多样性较Control组显著降低(P < 0.05)。与Control组相比, pSS组厚壁菌门/拟杆菌门比值降低; 普雷沃菌科、红蝽菌科、消化链球菌科、Eggerthellaceae, unidentified_Clostridiales丰度降低, 而拟杆菌科升高; 罗姆布茨菌属和Dorea等丰度降低, 拟杆菌属、韦荣球菌属等丰度升高。并且在pSS组肠道菌群中发现大肠埃希菌丰度明显升高。

pSS患者存在肠道菌群失调, 提示菌群失调可能与pSS的发生发展有关。

     

圈养食叶猴的肠道菌群特征

充分认识圈养食叶猴的肠道菌群组成特征, 为饲养管理方法的改进提供参考依据。

通过MiSeq高通量测序平台对3个物种的19个个体[黑叶猴(n=5)、川金丝猴(n=9)和西非黑白疣猴(n=5)]的肠道菌群16S rRNA V4-V5区进行测序和分析。

食叶猴肠道菌群以厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门, 瘤胃菌科、普氏菌科、理研菌科和毛螺菌科为优势菌科, 普氏菌属、密螺旋体属和瘤胃球菌属为优势菌属; 食叶猴物种间肠道菌群组成存在显著差异, 肠道菌群按照宿主物种聚类, 而不受环境因素的影响。

宿主物种是决定肠道微生物组成的重要因素, 食叶猴肠道菌群特征反映了宿主对其食性的适应。

     

夏季老年慢性阻塞性肺疾病患者口咽菌群分析

分析夏季老年慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者与健康人群的口咽菌群构成,旨在确定老年COPD患者与健康人群上呼吸道菌群间的差异。

选择2018年6—8月沈阳市沈阳医学院附属第二医院COPD患者29例和健康体检者25例,采集口咽拭子进行细菌16S rRNA高通量测序。通过菌群多样性分析、物种组成和物种差异分析,比较老年COPD患者与健康人群口咽部微生物的异同。

老年COPD患者口咽中菌群丰富度显著高于健康人群,物种多样性低于健康人群。在门水平上,老年COPD患者口咽菌群中拟杆菌门相对丰度降低,放线菌门相对丰度显著增高;在属水平上,老年COPD患者口咽菌群中罗氏菌属、放线菌属和劳特罗普氏菌属丰度均显著高于健康人群,奈瑟菌属和普雷沃菌属相对丰度降低,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

老年COPD患者口咽部正常菌群组成发生变化,机会致病菌如罗氏菌属、劳特罗普氏菌属比例增加,提示夏季老年COPD患者口咽菌群失调。

     

基于ITS2高通量测序 研究强直性脊柱炎患者肠道真菌特征

目的探究强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者肠道真菌菌群的多样性特征,分析健康人群与AS患者肠道真菌的结构差异。方法收集17例健康人群新鲜粪便样本和24例AS患者新鲜粪便样本,分别称为HC组和AS组,提取两组粪便样本总DNA;根据真菌ITS2区设计引物进行扩增,利用Illumina HiSeq PE250平台进行ITS2高通量测序;测序结果经过Reads拼接,OTUs(operational taxonomic units)聚类,Alpha和主成分分析,物种组成统计,显著性差异分析,最终得到样本物种信息。结果对肠道真菌菌群进行Alpha分析,各多样性指标中,shannon和observed_species指数差异有统计学意义(P0.05),其余指数差异均无统计学意义,故不能明确两组间多样性的差异。主成分分析提示差异显著。对肠道真菌结构进行分析,门的水平分析显示,担子菌门(Basidiomycota)在HC组和AS组中差异显著,接合菌门(Zygomycota)在两组间差异极显著;纲和属的水平分析显示,Ascomycota_unidentified纲在两组中差异显著,伞菌纲(Agaricomycetes)、Incertae_sedis_10纲、Orbiliomycetes纲差异极显著。Agaricomycetes_unidentified_1属、Amphinema属、Geoglossales_unidentified_1属、腔块菌属(Hydnotrya)差异显著,鹅膏菌属(Amanita)和锁瑚菌属(Clavulina)差异极显著。结论本实验证实了在AS患者中存在肠道真菌菌群失调,其特征是生物多样性和结构的改变,揭示肠道真菌也可能在AS发病中发挥作用。     

Increased Diversity of Fungal Flora in the Vagina of Patients with Recurrent Vaginal Candidiasis and Allergic Rhinitis

Recurrent vaginal candidiasis (RVC) is considered to be a hypersensitivity disorder that is associated with allergic rhinitis (AR) in immune deficiencies; however, whether or not the composition of the vaginal fungal flora in patients with AR and RVC is altered and if such alterations in patients with AR are associated with the development of RVC remain unclear. In the present study, a cultivation-independent method with the 18S rRNA gene clone library was used to analyze the diversity and composition of the vaginal fungal flora in patients with AR and RVC and to explore the association. Three fungal phyla (Ascomycotae, 22 out of 28; Basidiomycetes, 5 out of 28; and Oomycetes, 1 out of 28) were identified from groups of healthy volunteers, patients with AR, patients with RVC, and patients with RVC complicated by AR, including 28 phylotypes of fungal flora (10, 15, 17, and 21 phylotypes for each group, respectively). The predominant genera of fungi identified in the vagina included Candida, uncultured fungi, and Dothideomycetes. An increased proportion of Candida albicans accompanied with decreased proportions of Saccharomyces cerevisiae and uncultured fungi was observed in patients with AR or RVC (P?<?0.05). Candida glabrata, Eladia saccula, Trichosporon jirovecii, and Phytophthora spp. occurred simultaneously in the three patient groups. The composition of the fungal communities in the four groups was statistically different (P?<?0.001). The vaginal fungal diversity in patients with AR or RVC was significantly higher compared with healthy volunteers (P?<?0.05). The data revealed an increased diversity and varied composition of the vaginal fungal flora in patients with AR and RVC and indicated that disturbed vaginal fungal flora in patients with AR might be correlated with disease progression in patients with RVC.     

高通量测序技术对胚胎停育患者阴道真菌的研究

目的 通过高通量测序技术探究妊娠早期胚胎停育患者阴道真菌分布,比较其与正常早期妊娠者阴道真菌之间的差异,揭示胚胎停育与阴道真菌变化的相关性。 方法 选取2018年5月至2018年11月在兰州大学第二医院产科就诊的20例患者为研究对象,其中胚胎停育10例(实验组),正常早期妊娠10例(对照组)。分别取两组对象阴道分泌物样本行ITS rDNA高通量测序,测序数据进行OTU聚类分析,Alpha多样性和Beta多样性分析,组间群落差异性分析。 结果 实验组女性阴道真菌群落中未发现特征菌的存在,但菌群丰度显著高于对照组(P结论 阴道真菌丰度的显著变化可能与胚胎停育相关,尤其是Rhizopus丰度显著升高应当引起注意。     

婴幼儿腹泻患者肠道菌群分布特点研究

目的 研究不同年龄段腹泻患儿肠道菌群分布特点,探讨不同年龄腹泻患儿肠道菌群与疾病的关联。方法 选取9例符合临床诊断标准的0~1岁婴儿腹泻患者和8例符合临床诊断标准的1~3岁幼儿腹泻患者的粪便样本,同时于健康儿童中随机选取6例粪便样本作为对照,提取各组对象粪便总DNA,采用PCR-DGGE进行菌群多样性与差异性分析。结果 0~1岁腹泻患儿肠道菌群与健康对照组相比,肠道菌群构成差异显著,条件致病菌巴黎链球菌数量显著增加。1~3岁腹泻患儿肠道菌群与健康对照组相比,条件致病菌解没食子酸链球菌、屎肠球菌数量显著增加,长双歧杆菌数量下降。结论 婴幼儿腹泻患者肠道菌群的构成与健康对照组相比差异显著,该特点可作为婴幼儿腹泻早期诊断的实验依据。     

双相情感障碍患者健康状况与肠道菌群的相关性分析

探讨双相情感障碍（BD）患者健康状况与肠道菌群的相关性,为该类患者的治疗提供参考。

收集我院BD患者（BD组）和健康人群（健康对照组）的粪便样本,使用QIAamp^® DNA粪便抽提试剂盒进行粪便样本的总DNA提取,随后进行16S rRNA基因测序,使用主成分分析（PCoA）探究健康对照组和BD组患者肠道菌群多样性情况。采用BD患者自我报告健康问卷评估患者的健康状况。

BD患者肠道菌群Shannon指数（P = 0.020 5）、Chao指数（P = 0.025 1）和Simpson指数（P = 0.020 8）显著低于健康对照组（均P＜0.05）。加权的Unifrac PCoA分析表明,BD组患者肠道菌群相似性低于健康对照组。两组对象肠道菌群门水平上有差异的菌群为放线菌门和厚壁菌门;属、种水平上的差异菌群有普氏粪杆菌、梭状芽胞杆菌和瘤胃球菌属。两组对象在功能性身体健康（PCS）、心理健康（MCS）、睡眠质量（PSQI）、抑郁（PHQ-9）、焦虑（GAD-7）和狂躁（ASRM）的平均总成绩上差异均有统计学意义（均P＜0.05）。BD患者的功能性身体健康得分与肠道放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌属、梭状芽胞杆菌呈负相关,与普氏粪杆菌以及瘤胃球菌属呈正相关。

健康对照组和BD组患者的肠道菌群结构大致相似,BD患者的肠道菌群多样性低于健康对照组,BD患者健康状况与肠道菌群存在一定的相关性。

     

高原地区慢性肝病肠道微生态结构的变化

分析高原地区慢性肝病患者肠道菌群物种多样性及菌群丰度结构变化,探讨肠道微生态失衡与慢性肝病的关联。

收集高原地区90例慢性肝病（慢性乙型病毒性肝炎30例、乙肝后肝硬化30例、原发性肝癌30例）及25例健康人的粪便,利用高通量基因测序及生物信息学分析技术,探讨慢性肝病患者与健康人之间物种多样性以及不同分类水平上肠道菌群组成是否存在差异。

慢性肝病患者肠道菌群多样性较健康人显著降低（Z=1.462,P=0.005）,Beta多样性分析发现慢性肝病患者与健康人肠道菌群组成上差异存在统计学意义（r=0.122,P=0.020）;对慢性肝病组与健康组进行组间肠道菌群差异性分析,发现在门水平上,拟杆菌门在慢性肝病组中富集（Z=1.065,P=0.043）,慢性肝病组内比较发现拟杆菌门在慢性乙型病毒性肝炎、乙肝后肝硬化、原发性肝癌患者中的相对丰度呈逐渐减少的趋势,但差异无统计学意义（P＞0.050）;属水平上,粪杆菌属在慢性肝病组中富集（Z=1.092,P=0.032）,而肠球菌属分布减少（Z=1.398,P=0.036）,同时慢性肝病患者肠道菌群中一些潜在致病菌如链球菌属、韦荣球菌属较健康人富集,而双歧杆菌属、乳杆菌属等益生菌相对丰度较低,但差异无统计学意义。组内比较发现存在差异菌属链球菌属（H=6.026,P=0.049）、韦荣球菌属（H=10.317,P=0.005）,对差异菌属进行两两比较发现相较原发性肝癌组,链球菌属在乙肝后肝硬化组中更加富集,差异有统计学意义（P＜0.050）,同时发现肝硬化及肝癌组中韦荣球菌属的相对丰度较慢性乙型病毒性肝炎组高,但差异无统计学意义（P＞0.050）。相关性分析发现粪杆菌属与ALT、AST、ALP水平呈正相关（r=0.192、0.187、0.276,均P＜0.050）,韦荣球菌属与TB、ALP水平呈正相关（r=0.257、0.225,均P＜0.050）。

高原地区慢性肝病患者肠道微生物多样性显著降低,且慢性肝病患者与健康人肠道菌群组成上存在差异,在慢性肝病的进展中一些潜在致病菌的丰度逐渐增加,同时益生菌的相对丰度呈逐渐减少的趋势。

     

健康与患病刺梨植株可培养叶际真菌菌群差异比较

本研究比较了健康与患叶斑病刺梨植株叶际真菌群落特征差异,以期探索病原菌的潜在来源,为人工构建具拮抗功能群落和刺梨叶斑病的生物防控提供参考。通过可培养方法对不同健康状况的刺梨叶际真菌进行分离培养,结合形态学和分子系统学对菌株进行综合鉴定;利用FUNGuild平台对真菌进行功能注释;结合根际、根部真菌作拆分网络分析探索病原菌的潜在来源。本研究结果表明：1）刺梨叶际真菌具有丰富的多样性。从刺梨叶际8个样品中共分离到真菌266株,其隶属于3门、6纲、13目、30科、46属中的61个种。其中,健康植株叶际内生真菌（LHE）包括8属10种27株,附生真菌（LHS）包括33属37种77株。患病叶际内生真菌（LDE）分离到7属10种38株;附生真菌（LDS）分离到31属35种124株。2）不同样品的真菌优势属和特有类群有差异。不同健康状况下叶际附生真菌的优势属均为拟盘多毛孢属Pestalotiopsis,但二者的相对多度存在差异,LHS为11.49%,LDS为32.26%;内生真菌优势属二者均为链格孢属Alternaria,但相对多度各异,LHE为33.33%,LDE为63.16%。其中,LHE特有类群为盘长孢状刺盘孢 Colletotrichum gloeosporioides和果生刺盘孢Colletotrichum fructicola等8种;LDE特有类群为茄链格孢 Alternaria solani和Didymella sinensis 等8种;LHS特有类群是草酸青霉Penicillium oxalicum和Peniophora crassitunicata等21种;LDS特有类群是尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、赭绿青霉Penicillium ochrochloron和易脆毛霉Mucor fragilis等19种。3）不同样品叶际真菌功能不同。经FUNGuild解析表明,LHS、LHE和LDE的叶际真菌功能群主要以腐生型为主,LDS则主要以植物病原菌群为主。本研究结果初步揭示刺梨植株健康与患叶斑病叶际间真菌多样性、群落组成及营养功能群存在差异,植株健康状况与其真菌群落特征密切相关;叶斑病病原菌主要源于刺梨叶际的附生微生物群。