用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型的建立

本研究旨在建立可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型。利用脂质体将荧光素酶表达载体pGL4.17(luc2/neo)转染至人非小细胞肺癌细胞株A549,经G418筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆。根据体外生物发光情况及细胞的生长特性,从中挑选合适克隆,进行裸鼠皮下接种,SCID鼠尾静脉接种,建立肺癌移植瘤模型。利用活体成像系统监测肿瘤的生长转移情况,并用切片HE染色进一步验证小鼠模型移植瘤的原位成瘤和转移能力。实验结果表明:本研究成功地构建了可用于活体成像的小鼠肺癌移植瘤模型,模型稳定可靠、直观、灵敏,为肿瘤生长转移机制的研究及抗肿瘤药物的研发提供了重要工具。     

橘络活性成分小分子果胶治疗非小细胞肺癌作用及机制研究北大核心CSCD

本文观察橘络活性成分小分子果胶在离体细胞水平及整体动物模型中对非小细胞肺癌的治疗作用并初步探索其作用机制。小分子果胶处理人非小细胞肺癌PC-9细胞72 h后,MTS法检测细胞活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率;以PC-9细胞裸小鼠皮下移植瘤模型观察小分子果胶体内对肿瘤生长的抑制作用,免疫组化法检测肿瘤组织Ki67表达水平,TUNEL法检测组织中肿瘤细胞凋亡程度。结果表明小分子果胶(1.5~3 mg/m L)可显著抑制PC-9细胞增殖,与对照组相比细胞凋亡率显著升高,且具有浓度依赖性;小分子果胶(56.25 mg/kg)可显著抑制非小细胞肺癌小鼠体内肿瘤生长,肿瘤组织中细胞凋亡率显著升高。研究证明小分子果胶可显著抑制非小细胞肺癌小鼠体内肿瘤生长,该作用可能与小分子果胶抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡有关。     

骨髓间充质干细胞全细胞抗原干预移植瘤生长的实验研究

目的:探讨骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem cells,MSCs)的全细胞抗原(WCAs)对于人肺腺癌细胞株A549移植瘤的预防接种作用,为发掘肿瘤免疫治疗提供新策略。方法:采用全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs并以流式细胞仪鉴定,取3~5代MSCs细胞以15Gy X线灭活获取(Whole cell antigens,WCAs),以该抗原皮下接种于BALB/c小鼠(1次/3 d,共2周),获得免疫接种小鼠模型,对照组皮下注射同体积的PBS;为了方便示踪,以Lipofectamine TM 2000细胞脂质体转染绿色荧光蛋白(GFP),获得标记GFP-A549细胞株,皮下移植瘤株进行荷瘤,采用小动物荧光成像仪观察肿瘤生长;同时评估肿瘤直径并计算肿瘤体积,行Ki-67免疫组化染色初步分析肿瘤增殖能力。结果:肺腺癌GFP-A549细胞株皮下移植成功使小鼠荷瘤,实验组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组(P0.05,P0.01),小动物荧光成像仪结果与解剖结果一致;实验组Ki-67的表达低于对照组。结论:本研究采用MSCs获得WCAs在荷瘤前对小鼠进行免疫刺激,发现其确实有抑制肿瘤生长的作用。     

基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型建立

目的建立基于临床肿瘤标本的胃癌转移模型,为胃癌的转移研究提供个体化动物模型。方法将胃癌新鲜的手术标本移植到裸鼠皮下,建立胃癌患者异种移植(patient-derived xenograft,PDX)模型。进一步通过手术将皮下瘤组织原位移植到裸鼠胃部肌层,连续观察裸鼠的体征状态,通过近红外荧光活体成像技术检测肿瘤转移的发生。解剖荷瘤小鼠,将肺部转移灶进一步移植裸鼠皮下获得实体瘤。HE染色观察原发瘤与转移瘤的结构特征,(short tandem repeat) STR分析原发瘤和转移瘤的遗传特性。PCR-Array分析转移瘤和原发瘤中转移相关基因的表达。结果成功建立胃癌PDX模型,移植瘤组织结构与患者保持基本一致;通过胃部原位移植发现编号C19751的小鼠发生肺和肝的转移。其中肺转移灶皮下移植后获得了实体瘤,STR分析显示原发瘤保持了与肺转移瘤一致的遗传特征。PCR-Array结果显示,与原发瘤相比,转移瘤中CXCL12,IGF1和MMP2基因表达均显著上调。结论利用临床肿瘤标本成功建立胃癌转移模型,为胃癌转移研究提供了良好的个体化模型。     

从人体尿液中分离肾源细胞构建拟肾血管单位小鼠皮下嵌合模型及其初步评价

目的 将健康人体尿液中分离培养的肾源细胞与人源间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)以3∶3∶2的比例混合,并移植到NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下而构建人源化嵌合小鼠模型。方法 (1)体外培养MSCs、HUVECs,同时从健康人体尿液中分离培养肾源细胞,并对该细胞进行免疫荧光鉴定。(2)将上述3种细胞以3∶3∶2的比例混合后与Matrigel基质胶一起注射到NOD-SCID小鼠皮下形成人源组织,通过HE染色、免疫组织化学对移植模型进行鉴定。结果 (1)成功地从尿液中分离培养出肾源细胞,并检测鉴定了肾小管上皮细胞和集合管细胞;(2)将3种细胞混合后注射到NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下可初步形成小管结构以及与小鼠血管相连通的人源血管结构。结论 具有肾小管上皮细胞和集合管细胞的肾源细胞与HUVECs和MSCs皮下移植入NOD-SCID免疫缺陷小鼠体内可形成嵌合的人肾血管单位小鼠模型。该模型可为肾病个体化治疗和相关病毒感染研究提供一个人源化动物...     

肝细胞癌原位与皮下PDX模型的方法学比较分析研究

目的构建肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)原位与皮下人源肿瘤异种移植(patient-derived xenografts,PDX)模型,并比较分析两者生长和病理学特点。方法收集肝癌患者的新鲜肿瘤组织,接种肝和皮下组织,比较分析两者生长特性、病理特征、成瘤率和成瘤时间。结果本次研究成功构建肝癌原位和皮下PDX模型,两者与患者原发肿瘤病理特征一致,其中原位和皮下综合成瘤率分别为50%(3/6)和20%(3/15),平均成瘤时间为30 d和68 d。结论肝癌原位PDX模型成瘤率高,对于难生长肿瘤提供了一个新的建模方法,皮下成瘤操作和观察较为简单,在具体科研实践中应根据情况使用合适方法。它们为深入探索HCC的发病机制,及药物筛选提供有效的动物模型。     

橘络活性成分小分子果胶治疗非小细胞肺癌作用及机制研究

本文观察橘络活性成分小分子果胶在离体细胞水平及整体动物模型中对非小细胞肺癌的治疗作用并初步探索其作用机制。小分子果胶处理人非小细胞肺癌PC-9细胞72 h后,MTS法检测细胞活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率;以PC-9细胞裸小鼠皮下移植瘤模型观察小分子果胶体内对肿瘤生长的抑制作用,免疫组化法检测肿瘤组织Ki67表达水平,TUNEL法检测组织中肿瘤细胞凋亡程度。结果表明小分子果胶(1.5~3 mg/m L)可显著抑制PC-9细胞增殖,与对照组相比细胞凋亡率显著升高,且具有浓度依赖性;小分子果胶(56.25 mg/kg)可显著抑制非小细胞肺癌小鼠体内肿瘤生长,肿瘤组织中细胞凋亡率显著升高。研究证明小分子果胶可显著抑制非小细胞肺癌小鼠体内肿瘤生长,该作用可能与小分子果胶抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡有关。     

A549人肺癌细胞系/615-SCID小鼠转移瘤的生物学特征

目的通过建立A549人肺腺癌细胞/615-SCID小鼠模型,评价重度联合免疫缺陷615-SCID小鼠在建立人类肺癌转移模型方面的应用价值.方法将1×107A549细胞接种到615-SCID及SCID小鼠右上肢背部皮下,观察成瘤时间、成瘤率、肿瘤生长速度及转移发生.结果两品系小鼠接种后的成瘤率均为100%,615-SCID小鼠移植瘤潜伏期较长、生长较缓慢,更容易发生转移.结论 615-SCID小鼠比SCID小鼠更易于构建人类肺腺癌转移模型,对于肺癌转移特性研究具有较大的意义.     

近红外荧光染料在胃癌人源性肿瘤组织异种移植模型研究中的应用

目的建立胃癌人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived tumor xenograft,PDX)裸鼠模型,探讨近红外荧光(near infrared fluorescence,NIRF)染料IR-783在胃癌PDX模型活体成像研究中的应用。方法取临床胃癌新鲜手术切除标本,裸鼠肾包膜移植建立PDX模型,HE染色比较移植肿瘤组织与患者肿瘤组织形态结构的一致性。将移植肿瘤组织裸鼠皮下接种,20 d后,荷瘤小鼠腹腔注射NIRF染料IR-783(每只10 nmol/L),活体成像连续测定肿瘤部位近红外荧光强度并分析肿瘤体积与荧光强度的相关性;免疫组织化学检测移植肿瘤组织中HIF1α与OATP1B3的表达强度。结果成功建立了3个人胃癌PDX模型,移植肿瘤组织较好的保持了原发肿瘤的特征,NIRF活体成像早期检测到肾包膜部位荧光信号。PDX模型中肿瘤体积与荧光强度的相关性均在98%以上。移植肿瘤组织中HIF1α与OATP1B3表达呈强阳性。结论 NIRF染料IR-783可在PDX模型肿瘤部位特异性聚集,用于PDX模型的早期检测,这种肿瘤靶向性可能与HIF1α和OATP1B3的表达相关。     

人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型、细胞系建立及其生物学特性研究

目的建立人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型和相应体外细胞系.方法将病理证实的人卵巢浆液性乳头状腺癌手术切除标本移植于SCID小鼠皮下,成瘤后行鼠间传代,取移植瘤细胞体外分离培养、传代和建系,并应用细胞、分子生物学手段对移植瘤和建系细胞进行一系列生物学特性检测.结果历时14个月传至5代,皮下移植瘤存活率为90%,持续6个月,体外建系(OVA-319)细胞生长稳定.镜下观察组织形态学和超微结构符合原肿瘤组织基本特征;染色体分布在12～46条之间,多为异倍体,显示人类肿瘤异常染色体;流式细胞术和RT-PCR技术分析原代、体内移植瘤和OVA-319细胞结果一致,表现为瘤细胞生长活跃、细胞周期分布相仿,MAGE-2基因在mRNA水平异常表达.结论人卵巢癌SCID小鼠移植瘤模型和OVA-319细胞系为人类肿瘤的研究提供了良好的实验材料.     

Alu基因定量检测用于胃癌转移模型评估的研究

目的研究人胃癌转移裸鼠模型中人Alu基因的表达水平与组织脏器中胃癌转移程度的相关性,探索建立胃癌转移模型早期评估的分子生物学方法。方法分别以人胃癌细胞SGC-7901、MKN45和正常胃黏膜细胞GES1基因组DNA为模板构建标准质粒,通过实时荧光定量PCR检测不同比例胃癌细胞SGC-7901中Alu基因的表达,获取相关性曲线;选取胃癌细胞SGC-7901和MKN45,通过裸鼠皮下接种的方式构建人胃癌细胞异种移植转移模型,实时荧光定量PCR方法检测模型鼠肝、脾、肺、肾和皮下肿瘤组织中的人Alu基因表达,获得Alu基因的表达与各器官组织中肿瘤转移程度的相关性曲线;将临床胃癌患者新鲜肿瘤标本皮下接种裸鼠构建异种移植模型,进一步验证模型鼠各组织中人Alu基因的表达与器官中肿瘤转移程度的相关性。结果胃癌细胞SGC-7901的含量与其Alu基因的Ct值呈负相关(R2=0.9239);人胃癌细胞异种移植(CDX)裸鼠转移模型中,人Alu基因的表达在皮下肿瘤中处于较高水平,在肺转移瘤和肝转移瘤中的表达则介于正常裸鼠与皮下肿瘤之间,与组织病理学检查结果相符;胃癌病人肿瘤异种移植(PDX)模型中,已确定发生转移的脏器中虽未形成肉眼可见的转移灶,但其人Alu基因的表达(Ct值17.86)与正常裸鼠(Ct值22.18)差异显著(P 0.05);而对于肉眼可见的转移灶,其人Alu基因的表达(Ct值14.29)则差异极显著(P 0.01)。结论人胃癌裸鼠转移模型中,人Alu基因的表达与胃癌转移程度呈正相关,Alu基因表达越高,则该组织中转移的肿瘤细胞就越多,形成的转移灶越明显。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的:建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的方法并检测其生长特性。方法:剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果:组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论:本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。     

HOXC8通过调控PDX1的表达促进非小细胞肺癌的生长与EMT过程

摘要 目的：探索HOXC8与PDX1在非小细胞肺癌（non-small lung cancer, NSCLC）细胞生长及上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）的作用机制。方法：通过转录组测序、荧光定量PCR及染色质免疫沉淀等方法筛选并鉴定HOXC8调控的靶基因;通过Western blot、CCK-8、克隆集落生成及生物信息学等手段分析靶基因PDX1在非小细胞肺癌中的作用。结果：实验证明HOXC8可结合到PDX1基因的启动子上,并作为转录因子激活PDX1的表达。PDX1的表达促进NSCLC细胞的生长与EMT过程,而沉默PDX1能显著地抑制NSCLC细胞的生长与EMT过程,并诱导细胞的凋亡。通过分析已知的肿瘤数据库, 我们发现在NSCLC中PDX1的表达显著高于正常组织,且PDX1的高表达与肺癌患者的预后不良呈显著的相关性。结论：本研究发现HOXC8-PDX1轴在非小细胞肺癌中起着重要的调节作用, 可有望成为非小细胞肺癌治疗的新靶点。     

肺癌脑转移型A549/GFP-2 细胞的筛选及其条件液对脑微血管 内皮细胞的作用

目的：建立肺癌脑转移模型,筛选脑转移倾向细胞A549/GFP-2,探讨A549 和A549/GFP-2 条件液对脑微血管内皮细胞的作 用,揭示肺癌脑转移的机制。方法：利用胸腔原位注射法筛选出A549 脑转移细胞亚型A549/GFP-2,原代培养大鼠脑微血管内皮 细胞,观察A549和A549/GFP-2 细胞条件液对脑微血管内皮细胞增殖的影响和细胞内HIF-1琢和VEGF表达的改变。结果：胸腔 内原位种植较好地反应了临床肺癌脑转移的过程。不同浓度的A549 和A549/GFP-2 细胞条件液对脑微血管内皮细胞增殖的影响 不同,低浓度（＜ 30%）对脑微血管内皮细胞有促进的作用;高浓度（＞ 60%）对脑微血管内皮细胞的增殖有不同程度的抑制作用, 且有随浓度增加抑制作用增强的趋势。A549 和A549/GFP-2 细胞条件液能提高脑微血管内皮细胞内HIF-1alpha和VEGF 的表达。结 论：胸腔内原位种植是建立肺癌脑转移的稳定模型。肺癌脑转移与肺癌细胞在生长过程中分泌的HIF-1alpha和VEGF等细胞因子破 坏了脑微血管内皮细胞的结构有关。     

肺癌脑转移型A549／GFP-2细胞的筛选及其条件液对脑微血管内皮细胞的作用

目的：建立肺癌脑转移模型,筛选脑转移倾向细胞A549／GFP-2,探讨A549和A549／GFP-2条件液对脑微血管内皮细胞的作用,揭示肺癌脑转移的机制。方法：利用胸腔原位注射法筛选出A549脑转移细胞亚型A549／GFP-2,原代培养大鼠脑微血管内皮细胞,观察A549和A549／GFP-2细胞条件液对脑微血管内皮细胞增殖的影响和细胞内HIF-1α和VEGF表达的改变。结果：胸腔内原位种植较好地反应了临床肺癌脑转移的过程。不同浓度的A549和A549／GFP-2细胞条件液对脑微血管内皮细胞增殖的影响不同,低浓度（〈30％）对脑微血管内皮细胞有促进的作用;高浓度（〉60％）对脑微血管内皮细胞的增殖有不同程度的抑制作用,且有随浓度增加抑制作用增强的趋势。A549和A549／GFP-2细胞条件液能提高脑微血管内皮细胞内HIF-1α和VEGF的表达。结论：胸腔内原位种植是建立肺癌脑转移的稳定模型。肺癌脑转移与肺癌细胞在生长过程中分泌的HIF-1α和VEGF等细胞因子破坏了脑微血管内皮细胞的结构有关。     

人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠移植瘤模型的建立及生物学特性研究

目的-建立人乳腺癌MDA-MB-231细胞株裸小鼠模型,研究其生物学特性,观察MDA-MB-231乳腺癌细胞在移植前后的形态学变化。方法-将人乳腺癌细胞MDA-MB-231接种于裸鼠腋窝处皮下,每3天测量肿瘤大小,第30天处死小鼠。肿瘤组织及相关脏器送病理切片。皮下肿瘤组织细胞及细胞株培养HE染色。结果-肿瘤生长较快,成功率为72%,病理检查符合人乳腺癌细胞特征。肿瘤组织细胞及培养细胞形态学未见显著差异。结论-人乳腺癌细胞株MDA-MB-231裸小鼠模型建立方法较简便,细胞形态无明显差异,且保持了人乳腺癌的生物学特性。     

艾氏腹水癌克隆细胞株E2G8建立小鼠动物模型生物学特性研究

目的　比较不同品种 (系 )小鼠接种E2G8细胞株的某些生物学特性。方法　将E2G8细胞稀释成不同浓度 ,接种KM、DBA 2、6 15、C57BL 6及BALB c小鼠皮下或腹腔 ,观察小鼠出现可见肿块 腹水时间及小鼠生存时间 ;测量肿块直径 (cm)及瘤重 ;荷瘤小鼠腹腔注射环磷酰胺 (CTX) ,观察E2G8细胞肿瘤模型对CTX治疗的敏感性。结果　E2G8接种BALB c、6 15小鼠皮下毒性最大 ,DBA 2、C57BL 6小鼠次之 ,接种KM小鼠皮下毒性最小 ;接种DBA 2、C57BL 6、6 15小鼠腹腔毒性较大 ,致死性高 ,对BALB c和KM小鼠的致死性弱 ;E2G8瘤细胞在KM和 4种纯系小鼠皮下均能很好生长肿瘤 ,其中在KM小鼠皮下肿瘤生长最大 ,在BALB c小鼠皮下肿瘤最小 ;KM、C57BL 6、6 15、DBA 2、BALB c小鼠皮下接种瘤细胞第 12天瘤重分别为 (2 4 0± 1 30 ) ,(0 90± 0 4 8) ,(1 2 0± 0 38) ,(1 10± 0 2 9) ,(0 80± 0 30 )g ;E2G8细胞接种 5个不同品种 (系 )小鼠制备的肿瘤模型 ,用CTX治疗 ,抑瘤率由高到低依次为6 6 7% (6 15 ) ,5 5 0 % (BALB c) ,5 3 3% (C57BL 6 ) ,5 0 % (KM) ,36 4 (DBA 2 ) ,其中 6 15小鼠建立的模型对CTX的治疗最敏感。结论　E2G8细胞株接种 5个不同品种 (系 )小鼠 ,所测生物学特性不完全相同 ,但是从腹腔 皮下接种、CTX     

敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖

细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道。构建Wdr1条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况。PCR结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre小鼠模型构建成功。免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞。细胞形态观察结果显示:Wdr1敲除后对细胞的形态有显著性影响。同时,划痕实验以及CCK8检测结果也表明:Wdr1的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖。Wdr1敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义。     

多重定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的构建

摘要 目的：建立一种快速、灵敏的方法检测人源异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)中小鼠细胞的浸润比例,以确保PDX模型的保真性。方法：选择人和小鼠的特异性基因PSMB2、Ren 2的部分区段设计引物和探针,利用多重荧光定量PCR（TaqMan探针法）在单管中检测PDX模型中小鼠-人细胞的相对量。另外,构建了不同浸润比例的标准品作为阳性对照,根据标准曲线进行样本比例计算。结果：建立了一种多重荧光定量PCR检测PDX模型小鼠细胞浸润比例的检测方案,该方案显示,PDX模型中不同比例的人鼠混合样本与△Ct值（Ct（小鼠）-Ct（人））之间线性关系良好,相关系数r²为0.9998。利用该方法对14个样本进行检测,结果表明在绝大部分样本中小鼠细胞的比例低于30.00%,平均小鼠细胞比例为13.38%。结论：本研究建立的多重定量PCR检测PDX模型中小鼠细胞浸润比例的方法能够根据△Ct值快速、准确推断PDX模型中人、小鼠细胞的比例。该方法操作简单、耗时短、结果可靠,是一种快速、灵敏的PDX模型的质控方案。