血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。经基因组PCR和Southern Blot鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Cre基因,整合率为11％。为了验证Cre重组酶的剪切活性和表达组织分布,我们将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和报告小鼠ROSA26交配。Tie2-Cre;Smad4^co/＋小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示,Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎LacZ染色结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。因此．Tie2-Cre转基因小鼠可作血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。     

内皮细胞条件性敲除EMCN小鼠模型建立及肿瘤肺转移对比分析

目的 建立内皮细胞条件性敲除EMCN基因小鼠模型,探讨C57BL/6小鼠与内皮细胞条件性敲除EMCN小鼠模型体内肿瘤肺转移存在的差异。方法 将内皮细胞特异性Tek-CreERT2小鼠与EMCN^flox/flox小鼠杂交,将子代雄性EMCN^flox/wt/Tek-CreERT2⁺与雌性EMCN^flox/flox小鼠交配,取得内皮细胞特异性敲除EMCN基因小鼠(EMCN^flox/flox/Tek-CreERT2⁺,EMCN^ecko)。通过在DNA和蛋白水平验证基因敲除准确性及效率,提取小鼠基因组DNA后,PCR扩增检测Tek-CreERT2及FLOX位点,Tamoxifen诱导后,Western Blot检测组织中EMCN蛋白的表达。对正常C57BL/6小鼠与EMCN^ecko小鼠表型进行观察及脏器HE染色。为了证实EMCN敲除对肿瘤转移的影响,将LLC细胞尾静脉注射C57BL/6与EMCN^ecko     

巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠的构建及功能分析

目的 构建并鉴定巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠,为研究CD226分子调节巨噬细胞表型和功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法 通过Cd226^flox/+雌雄小鼠自交,得到基因型Cd226^flox/flox小鼠。Cd226^flox/flox与Lyz2-Cre⁺小鼠杂交,获得Cd226^flox/+Lyz2-Cre⁺小鼠,再将其与Cd226^flox/flox小鼠杂交,最终获得Cd226^flox/floxLyz2-Cre⁺小鼠,即巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型;采用流式细胞术、qRT-PCR和Western Blot验证小鼠巨噬细胞CD226敲除效果;采用Transwell实验检测CD226对小鼠巨噬细胞迁移能力的影响。结果 从基因和蛋白水平证实巨噬细胞条件性Cd226基因敲除小鼠构建成功。Transwell实验结果显示,与对照组相比,巨噬细胞条...     

血管平滑肌细胞过表达人EP4受体改善血管紧张素Ⅱ诱导的高血压

前列腺素E_2(prostaglandinE_2,PGE_2)在心血管系统中具有重要的调节作用,PGE_2通过G蛋白耦联受体(EP1、EP2、EP3、EP4)参与机体血压的稳态维持。本文旨在利用血管平滑肌细胞特异性人EP4转基因小鼠(VSMC-hEP4 Tg)研究血管平滑肌细胞过表达人EP4受体对小鼠血压的作用及机制。通过转基因技术构建VSMC-hEP4 Tg小鼠并进行鉴定;使用尾套法测定小鼠在基础状态及高、低盐饮食条件下的血压水平;在小鼠背部皮下埋置血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)缓释泵后检测其血压变化;颈动脉插管法测量小鼠血压对Ang Ⅱ静脉灌注的急性反应以及两种EP4特异性激动剂(CAY10580和CAY10598,0.5 mg/kg)对小鼠血压的影响;使用血管张力仪测定小鼠肠系膜动脉血管环对Ang Ⅱ诱导的血管收缩力;运用Western blot检测EP4特异性激动剂PGE1-OH对Ang Ⅱ诱导的肌球蛋白磷酸酶靶亚基1 (myosin phosphatase target subunit 1, MYPT1)磷酸化的作用。结果显示:与野生型(wild type, WT)小鼠相比,VSMC-hEP4 Tg小鼠基础血压明显较低,在高、低盐饮食条件下其血压均保持较低水平;VSMC-h EP4 Tg小鼠的血压在Ang Ⅱ缓释给药及静脉灌注后均显著低于WT小鼠,其肠系膜血管环对Ang Ⅱ的反应性也明显下降。此外,CAY10580和CAY10598均能使WT小鼠血压显著降低。进一步研究发现,PGE1-OH可抑制肠系膜动脉中Ang Ⅱ介导的MYPT1 Thr696位点的磷酸化。以上结果表明,血管平滑肌细胞特异性过表达人EP4基因可显著降低小鼠基础血压,并能减轻Ang Ⅱ诱导高血压的发生,其机制可能与EP4抑制Ang Ⅱ的信号通路有关,提示基于EP4特异性的长效激动剂的开发可能在高血压防治中有重要价值。     

桂皮醛激活血管内皮TRPA1防止高糖诱导的氧化应激保护血管内皮功能

目的:探索桂皮醛对高糖诱导的内皮细胞氧化应激的影响及其对相关血管内皮功能损害的作用,初步分析其作用机制。方法:(1)制作高糖(30 m M)致人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤和血管组织损伤模型,并以低糖(5.5 m M)作为对照,高糖干预的HUVECs给予桂皮醛(10μM)或桂皮醛+TRPA1特异性拮抗剂(HC030031,10μM)进行干预,以DHE染色和DAF-2DA染色观察各组细胞超氧阴离子和一氧化氮(NO)水平;western blotting分析核因子E2相关因子2(Nrf2),内皮一氧化氮合酶(eNOS),磷酸化eNOS及P22~(phox)水平。(2)以TRPA1敲除(TRPA1~(-/-))及相应的野生型(Wild type,WT)小鼠分离胸主动脉进行体外培养,设低糖(5.5 m M D-葡萄糖)组、高糖(30 m M D-葡萄糖)组、高糖+桂皮醛(10μM)组,以微血管张力测定仪测定血管内皮依赖性舒张功能和非内皮依赖性舒张功能。结果:(1)桂皮醛可显著减少高糖介导的内皮细胞超氧阴离子的产生,防止NO水平下降,但上述作用可被HC030031所阻断。(2)桂皮醛可显著防止WT小鼠胸主动脉血管内皮依赖性舒张功能减退,但对TRPA1~(-/-)小鼠无上述作用。(3)桂皮醛剂量依赖性地上调Nrf2的表达,还可促进eNOS磷酸化,减少P22~(phox),上述作用均可被HC030031阻断。结论:桂皮醛激活TRPA1通过Nrf2信号通路可改善高糖介导的血管内皮细胞氧化应激水平,防止NO水平下降,改善血管内皮依赖性舒张功能。     

姜黄素激活AMPK抑制高糖介导的氧化应激水平升高致血管内皮功能障碍

目的:探索姜黄素对高糖介导的血管氧化应激水平的升高和血管功能的保护作用未知及相关的机制。方法:以高糖DMEM培养基复制人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的高糖损害模型。姜黄素干预24h后以DHE荧光探针分析姜黄素对高糖介导的活性氧产生的影响;分离健康C57BL/6J小鼠胸主动脉,以高糖DMEM培养基进行体外培养制作高糖介导的血管损害模型,分析姜黄素对高糖介导的血管功能的影响。利用western blotting方法检测血管内皮细胞中p-e NOS及p-AMPK的表达水平。结果:姜黄素可显著减少高糖介导的血管内皮细胞活性氧水平,该作用在给予AMPK抑制剂后显著降低;姜黄素可显著促进高糖环境血管内皮细胞e NOS的磷酸化并可显著改善高糖环境下小鼠胸主动脉的血管内皮依赖性舒张功能。Western blotting结果表明,姜黄素可显著增加p-AMPK的表达。结论:姜黄素显著减轻高糖血管内皮细胞的氧化应激水平,改善血管内皮依赖性舒张功能,而该作用可能与其通过激活AMPK/e NOS通路有关。     

Pd-1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的:细胞程序性死亡蛋白(programmed death ligand-1,PD-1)是机体T细胞的免疫检查点,也是肿瘤治疗的重要靶点。采用CRISPR/Cas9技术,利用非同源重组修复引入突变的方式,使基因蛋白读码框移码造成PD-1功能缺失,建立Pd-1基因敲除小鼠模型,为深入探究Pd-1基因功能及作用机制提供基础。方法:针对Pd-1基因2-4号外显子设计并合成2对sgRNA片段,与编码Cas9片段共同体外转录,通过受精卵显微注射方法将两者mRNA混合注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经PCR产物测序鉴定获得F0代小鼠,之后与野生型C57BL/6小鼠交配获得F1代杂合子小鼠,F1代小鼠自交即获得F2代纯合子小鼠品系(Pd-1^-/-)。刀豆蛋白(concanavalin A,ConA)刺激Pd-1^-/-小鼠后,通过实时荧光定量PCR和流式细胞技术在mRNA和蛋白水平上分别检测Pd-1^-/-小鼠中Pd-1基因在转录和翻译过程中的表达情况,并通过ELISA方法检测Pd-1^-/-小鼠血清中IL-6、IFN-γ、IL12/IL23及TNF-α等因子的表达水平,初步分析Pd-1通路在T细胞反应调控中的作用机制及对免疫刺激的响应情况。结果:PCR及测序结果表明在小鼠基因组中Pd-1基因2-4号外显子被成功敲除;Real-Time PCR实验和流式检测结果显示:与野生型小鼠相比,Pd-1^-/-小鼠脾、肠系膜淋巴结、胸腺和血液各组织中Pd-1表达水平均显著降低;双抗夹心ELISA测定结果显示:Pd-1敲除后经ConA刺激,血清中IL-6和IFN-γ表达上调。结论:成功构建Pd-1基因敲除小鼠模型。Pd-1缺失能够上调IL-6和IFN-γ对ConA刺激的响应,增加ConA引起的炎症反应,为Pd-1的体内基因功能研究提供了新的小鼠模型和研究思路。     

超氧阴离子抑制大鼠肠系膜阻力血管内皮依赖性舒张功能

目的:研究超氧阴离子对大鼠肠系膜阻力血管内皮细胞超极化因子(EDHF)和一氧化氮(NO)引起的血管舒张作用的影响及其可能机制.方法:雄性Sprague-Dawley大鼠,取肠系膜血管三级分支约2 mm长血管环,置于DMT 610 M系统,记录张力变化.血管环浴液中加入焦酚建立超氧阴离子损伤模型.结果:焦酚(10,100,300和1 000 μmol/L)可浓度依赖性地引起乙酰胆碱(ACh)诱导的肠系膜阻力血管舒张功能减弱;其中,300 μmol/L焦酚显著减弱肠系膜血管环由ACh诱导的EDHF和NO介导的内皮依赖性血管舒张效应,但对硝普钠和吡那地尔引起的内皮非依赖性的血管舒张作用无明显影响.结论:超氧阴离子可减弱阻力血管内皮依赖性舒张反应,其机制可能与超氧阴离子抑制了阻力血管内皮细胞EDHF和NO的作用有关.     

水通道 AQP1 敲除小鼠肿瘤血管生成障碍及肿瘤生长减缓

血管生成是肿瘤生长、浸润和转移的必要步骤. 肿瘤血管生成涉及瘤旁组织血管内皮细胞增殖、向肿瘤细胞团内迁移以及管腔形成,目前机理尚不完全清楚. 水通道 AQP1 在多种肿瘤血管内皮高表达,提示其可能参与肿瘤血管的生成过程. 应用 AQP1 敲除小鼠荷瘤实验证实了 AQP1 在黑色素瘤生长和血管新生中的作用. 结果表明,皮下接种的黑色素瘤在 AQP1 敲除小鼠的生长较之在野生型小鼠延迟近 30％ (P<0.01). 免疫组化与肿 瘤病理形态学分析显示, AQP1 在野生型小鼠黑色素瘤血管内皮细胞上高表达,而在 AQP1 敲除小鼠黑色素瘤血管内皮细胞呈阴性表达. 在病理结构上,黑色素瘤细胞围绕血管分支呈岛状分布. 野生型小鼠黑色素瘤内血管管腔较细小,而 AQP1(－/－)小鼠黑色素瘤内血管床显著膨大. AQP1(－/－)小鼠肿瘤内平均微血管密度 (47/mm²) 较之 AQP1(＋/＋) 肿瘤 (142/mm²) 减少 67％ (P<0.01). 围绕 AQP1(－/－) 肿瘤血管的肿瘤细胞岛周边坏死区域明显大于 AQP1(＋/＋)肿瘤. 上述结果提出确切证据表明, AQP1 缺失使肿瘤血管生成发生障碍,从而影响了肿瘤血液供应和肿瘤生长. AQP1参与肿瘤血管生成的机理值得深入研究.     

Cx43基因敲除鼠胚心脏近端流出道组织中Galpha13信号通路基因的差异表达

目的研究Cx43基因剔除(Cx43KO)小鼠胚胎心脏近端流出道组织中基因表达谱的改变,筛选可能导致Cx43KO小鼠流出道梗阻的相关基因。方法以胎龄(embryonic day,ED)14.5天的Cx43KO和野生型(Cx43WT)鼠胚心脏近端流出道部分为研究对象,分别提取总RNA,逆转录成cDNA;并在体外转录为cRNA,同时进行生物素标记及片段化;再与Affymetrix-4302.0基因芯片进行杂交。杂交信号经扫描后,应用相关生物信息软件分析基因表达情况。结果与Cx43WT组相比,Cx43KO组中表达上调2倍以上的基因共有287个,表达下调2倍以上的基因有199个。其中表达差异的基因参与转录调控、细胞周期等主要生理过程。进一步筛查表达差异1.5倍以上的基因发现,Galpha13信号通路上的多个基因在Cx43KO组有明显变化。结论利用基因芯片技术初步筛选出与Cx43KO鼠胚心脏近端流出道发育有关的多个基因,其中Galpha13信号通路上的相关基因可能与Cx43KO小鼠流出道梗阻的发生有关。     

AP-2α在小鼠血管内皮细胞中上调VEGF的表达

转录因子AP-2α(activating protein 2α)在哺乳动物发育、分化以及肿瘤的发生等生命现象中起重要作用,最近的研究发现.在HaCaT角化细胞中,AP-2α可以影响vaseular endothelial growth factor(VEGF)的表达.对C 57BL/6J小鼠胸主动脉血管内皮细胞进行了原代培养,取2～4代细胞分别以转染质粒pCMV-Myc,pCMV-Myc-AP-2α,pCMV-Myc-VEGFA以及SiRNA-AP-2α,Control-RNAi-AP-2α,SiRNA-VEGFA,Control-RNAi-VEGFA.然后采用实时定量RT-PCR和Western Blot分别检测Ap-2α和VEGF mRNA与蛋白的表达水平.结果发现在小鼠血管内皮细胞中AP-2α的过表达可使VEGF mRNA和蛋白质表达水平上升:培养细胞转染SiRNA-AP-2α后可使VEGF mRNA的表达和蛋白的表达水平下降:而VEGF的过表达及SiRNA-VEGFA对AP-2α mRNA和蛋白的表达水平没有明显影响,因此,在小鼠血管内皮细胞中AP-2α可上调VEGF的表达.     

Rad21基因位点的遗传修饰抑制骨骼肌干细胞分化

细胞谱系分化受到遗传、表观遗传、三维基因组结构的复杂调控。在真核细胞三维基因组结构中,黏连蛋白(cohesin)复合物介导染色质成环和拓扑相关结构域的形成。为了探讨Cohesin复合物介导的染色质高级结构是否调控成体干细胞分化及其相关基因表达,该研究选择了Cohesin复合物的一个亚基RAD21,制备了可诱导型RAD21蛋白降解的基因敲入小鼠模型(auxininducible degron,AID)。当auxin存在时,泛素连接酶Os TIR1降解含有AID标签的RAD21蛋白。小鼠制备策略是:在Rad21基因3′端引入了Loxp-Stop-Loxp-AID-EGFP-P2A-Os TIR1元件(Rad21^Aid/+),与骨骼肌成体干细胞特异的Cre工具鼠(Pax7-Cre)配繁,通过auxin诱导,在骨骼肌成体干细胞中特异降解RAD21蛋白,从而探究RAD21蛋白缺失对骨骼肌成体干细胞分化及相关基因表达的影响。该研究取得意外的结果:Rad21基因敲入的纯合子小鼠(Rad21^Aid/Aid,Hom)比野生型小鼠(WT)出生率显著降低;出生的H...     

Chemerin敲除在有氧运动改善高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝中的作用及机制

该文利用两种chemerin敲除小鼠研究脂肪因子chemerin在基础和运动状态对高脂喂养小鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的影响及其机制。通过cre-loxp系统构建脂肪chemerin敲除adipochemerin^–/–小鼠和全身性chemerin敲除chemerin^–/–小鼠。将雄性野生型(WT)、adipo-chemerin^–/–和chemerin^–/–小鼠进行12周饮食干预,分为普通饮食(ND)和高脂饮食(HFD)组。此外,将高脂喂养6周的上述三组小鼠进行6周中等强度的跑台运动干预,即WT+E、adipo-chemerin^–/–+E和chemerin^–/–+E组。检测小鼠体质量、肝质量,血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量、血脂四项、肝组织病理学形态,以及多个肝脏的脂肪代谢调控蛋白和关键酶的蛋白水平。结果显示,(1)与ND相比,HFD的WT小鼠肝质量增加,血脂异常,血清ALT、AST含量升高,肝脏出现大、黄、油特征,表现出NAFLD表...     

缝隙连接在同型半胱氨酸介导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的:探讨缝隙连接(GJ)是否参与同型半胱氨酸(Hcy)介导的自发性高血压(SHR)大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖及可能的分子机制。方法:原代培养SHR VSMCs,细胞分四组:①对照组,②Hcy组,③缝隙连接阻断剂(18α-GA)组和④Hcy+18α-GA组。MTT法及流式细胞仪检测细胞的增殖活性,免疫荧光技术观察细胞中Cx43、Cx40蛋白表达及定位,Western blot法检测细胞中Cx43、Cx40蛋白表达,染料示踪分子传递法(划痕标记染料传输法)检测细胞的缝隙连接功能。结果:①与对照组相比,Hcy组MTT法测得A值及细胞周期测得S值增高(P0.05),18α-GA组降低(P0.05);与Hcy组比,TGFβ-1+18α-GA组A值及S值均降低(P0.05)。②免疫荧光技术检测细胞中Cx43、Cx40蛋白表达呈阳性,两者共定位于胞浆。③与对照组相比,Hcy组Cx43、Cx40蛋白表达增强(P0.05),18α-GA组Cx43、Cx40表达均减弱(P0.05);与Hcy组比,Hcy+18α-GA组Cx43、Cx40表达均减弱(P0.05)。④与对照组相比,Hcy组缝隙连接功能明显增强(P0.05),18α-GA组缝隙连接功能明显减弱(P0.05),与Hcy组比,Hcy+18α-GA组缝隙连接功能显著降低(P0.05)。结论:Hcy通过上调SHR VSMCs Cx43和Cx40的蛋白表达,引起缝隙连接通讯功能的增强,促进了SHR VSMCs增殖。     

Irgm 1参与动脉粥样硬化斑块的形成

目的:探讨免疫相关GTP酶1(Irgm 1)对小鼠血管动脉粥样硬化(AS)斑块形成的影响。方法:高脂饲料喂养野生型(WT)、ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)和ApoE~(-/-)Irgm1~(+/-)小鼠3个月,建立AS模型;取小鼠主动脉弓,免疫荧光染色方法观察WT和ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)小鼠血管AS斑块中Irgm 1的表达情况及部位;Western blot方法检测WT和ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)小鼠血管AS斑块中Irgm 1蛋白表达情况;Q-PCR方法检测WT和ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)小鼠血管AS斑块中Irgm 1 m RNA表达情况;油红O染色观察ApoE~(-/-)Irgm1~(+/+)和ApoE~(-/-)Irgm1~(+/-)小鼠血管AS斑块形成情况;结果:与WT组相比,ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)组小鼠主动脉弓AS斑块中Irgm 1+细胞明显增多,Irgm 1+细胞主要位于血管AS斑块的表面;与WT组相比,ApoE~(-/-)Irgm 1~(+/+)组小鼠血管AS斑块中Irgm 1蛋白表达显著增多(P0.001),Irgm 1 m RNA表达显著增多(P0.01);与ApoE~(-/-)Irgm1~(+/-)组相比,ApoE~(-/-)Irgm1~(+/+)组小鼠主动脉弓AS斑块面积显著增大(P0.01);结论:Irgm 1能够促进血管AS斑块的形成。     

基于CRSIPR/Cas9技术构建凝血因子8基因敲除小鼠模型及表型验证

基于CRISPR/Cas9技术构建凝血因子8(F8)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。针对F8基因外显子1非编码区和外显子26下游序列设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F₀代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得F8基因敲除纯合子小鼠(F8^-/-小鼠);通过逆转录PCR(RT-PCR)检测主要组织中F8基因在mRNA水平的表达情况,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血浆中F8基因在蛋白水平的表达情况;通过活化部分凝血活酶时间检测(APTT)和纤维蛋白原含量(FIB)测定实验检测F8基因敲除后小鼠凝血功能情况。PCR及测序结果表明F8基因在小鼠基因组中被成功敲除;RT-PCR 和ELISA检测结果显示,F8^-/-小鼠中F8在mRNA和蛋白水平上表达均显著低于野生型小鼠(WT小鼠)(P<0.000 1,P<0.01);APTT、FIB和滴血实验检测结果显示,F8^-/-小鼠血浆凝固时间显著高于WT小鼠(P<0....     

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

转基因小鼠源性胰腺癌原位移植瘤模型的构建与评价

目的 构建转基因LSL-Kras^G12D/+LSL-Trp53^R172H/+Pdx1-Cre(KPC)小鼠胰腺癌原位移植瘤模型,为研究胰腺癌的发展机制和治疗策略提供稳定、可靠的药物临床前研究动物模型。方法 将KPC转基因小鼠的自发胰腺癌的组织块进行C57BL/6J小鼠胰腺原位移植,利用超声进行肿瘤监测,对原发肿瘤和传代肿瘤进行苏木精-伊红(HE)染色和免疫荧光染色评价模型的肿瘤病理学特征。结果 KPC小鼠的自发肿瘤能够在C57BL/6J小鼠的胰腺上稳定生长,肿瘤增殖指标Ki67、基质纤维化标志物α-SMA、免疫细胞标志物CD45和CD206均稳定表达,该模型能够稳定地保留原发胰腺癌病理学特征,并发生与临床胰腺癌患者相似的广泛转移。结论 成功建立转基因小鼠源性胰腺癌原位移植瘤模型,该模型能够模拟出胰腺癌的基质环境和免疫细胞浸润情况,具有较好的稳定性和均一性,可以作为研究胰腺癌进展和治疗策略的有效药物临床前研究模型。     

硫辛酸合成酶低表达对小鼠抗氧化能力的影响

目的 建立一种硫辛酸合成酶基因低表达的基因修饰小鼠,并检测其抗氧化能力。方法 将硫辛酸合成酶基因3’-UTR区域Loxp小鼠与E2a-Cre小鼠杂交,从子代小鼠中鉴定出Lias^L/+小鼠并进一步繁殖、鉴定基因型。选取基因型为Lias^L/L和Lias^+/+的8周龄雄性小鼠各10只;称重、麻醉后经股动脉采血,然后分离小鼠肺、肾及肝,并称重。应用Western Blot、免疫组化方法检测肺、肾、肝组织中硫辛酸合成酶(LIAS)蛋白的表达水平;分离血清,检测总抗氧化能力(TAC);对肾、肝、肺匀浆后提取总蛋白,检测其SOD、CAT酶活性及MDA含量。结果 Western Blot及免疫组化分析显示,除小鼠肝LIAS免疫组化分析结果外,Lias^L/L组小鼠较Lias^+/+组小鼠肾、肝及肺组织中LIAS蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。与Lias^+/+组小鼠相比,Lias^L/L组小鼠血清TAC水平显著降低(P<0.05),Lia...     

胸腺上皮细胞特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型的鉴定及免疫学特征观察

目的 构建并鉴定胸腺上皮细胞(thymic epithelial cells, TECs)特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型,评价其免疫学特征。方法 采用小鼠胚胎干细胞(ES细胞,embryonic stem cells)打靶基因敲除技术,得到F0代的GSK-3β^flox/flox(GSK-3β^f/f)小鼠;再采用Cre-LoxP系统进行小鼠的繁殖;PCR鉴定,筛选出基因型为GSK-3β^f/fFoxN1-Cre^+/-(GSK-3β^-/-)小鼠,即为在TECs特异性敲除GSK-3β基因的小鼠。观察基因敲除鼠的一般生物学特征、繁殖能力和子代存活率。应用HE染色、流式细胞术及免疫荧光技术,比较基因敲除鼠和野生型小鼠免疫器官结构、胸腺、脾及外周血中免疫细胞比例及增殖能力差异。结果 成功构建TECs特异性敲除GSK-3β基因小鼠模型。与野生型(wild type, WT)小鼠相比,GSK-3β^-/-小鼠一般生物学特征无明显差异,子代存活率> 90%;衰老进程中...