卡介苗荚膜阿拉伯甘露聚糖的提纯鉴定及其免疫调节功能的初步研究

确定卡介苗(BCG)中荚膜中糖成分阿拉伯甘露聚糖(AM)的功能。

本研究从我国目前普遍使用的BCG中, 利用氯仿甲醇抽提方法分离纯化荚膜AM, 经AM单克隆抗体鉴定后, 腹腔注射BCG致敏小鼠, 体内外评价AM的免疫调节功能。

AM能在小鼠体内增强BCG诱导的迟发型超敏反应(P < 0.01), 体外免疫指标检测发现AM提高小鼠脾细胞Th1类细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平(P < 0.05)。

BCG的荚膜AM是潜在的保护性抗原, 并为优化BCG提供理论依据。

     

MALDI-TOF MS在快速检测碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌及其同源性分析中的应用

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)筛选碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKp)特异性峰, 并进行同源性分析。

收集30株CRKp临床分离株, 采用法国梅里埃VITEK 2 Compact分析仪进行细菌鉴定和药敏试验、利用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)检测碳青霉烯酶; 利用MALDI-TOF MS技术筛选CRKp菌株特异性峰, 采用MALDI-TOF MS进行同源性分析, 多位点序列分型(MLST)方法作为验证。

30株CRKp株mCIM均为阳性, 其中24株含有共同特异性峰, 特异性达到80%, 符合区分阈值。蛋白质质量峰聚类分析显示, 30株CRKp株分为三大簇, 同时MLST结果表明, ST11/A型为27株、ST15/B型为2株, 而ST2193/D型仅有1株。

MALDI-TOF MS在CRKp鉴定中具有精准、快速的优点。MALDI-TOF MS能够有效进行CRKp同源性分析, 并应用于院内感染流行暴发的监测。

     

跨膜蛋白CD82在流感病毒感染初期的表达

了解细胞跨膜蛋白CD82在流感病毒感染初期的表达变化,分析CD82在流感病毒感染中的作用。

采用逆转录−聚合酶链式反应（RT-PCR）方法对流感病毒感染4 h内的HEP-2细胞中CD82蛋白mRNA表达量进行检测。

流感病毒感染HEP-2细胞后1 h−3 h细胞 CD82的mRNA表达量降低,并且随着流感病毒接种量增加CD82表达量降低持续时间延长。

流感病毒可以在转录水平调节宿主细胞CD82的表达。CD82在流感病毒感染初期表达下降,提示CD82可能在流感病毒与宿主细胞粘附和入侵过程中发挥作用。

     

胶体金免疫层析法检测猪链球菌2型的研究

目的:制备胶体金免疫层析试纸检测猪链球菌2型.方法:用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒,标记猪链球菌2型多克隆抗体,通过免疫层析作用对猪链球菌2型进行检测,并对试纸条的敏感性、特异性、稳定性进行评价.结果:每毫升胶体金最佳抗体标记量为22μg/mL,最佳包被抗体浓度为2 mg/mL,最佳BSA封闭浓度为1.5%,建立的胶体金免疫层析试纸条栓出猪链球菌2型的下限为106 CFU/mL,从检测到结果判断时间为5～15 min,与其他常见致病菌及链球菌属中15个群无交叉反应.结论:获得了检测猪链球菌2型的胶体金免疫层析试纸,该法操作简便,灵敏度高,特异性强,可用于猪链球菌的快速初筛和检测.     

人肺炎链球菌快速检测胶体金试纸的研制

[目的]研制一种快速检测人肺炎链球菌(S. pneumoniae)的免疫胶体金层析试纸。[方法]对肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)基因序列(Gen Bank:U89711)作生物信息学分析,选取抗原表位强、种内同源性高的片段克隆表达纯化重组蛋白rPspA,并免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体;以双抗夹心法制备胶体金免疫层析试纸,并对其特异性、灵敏度以及稳定性进行验证分析。[结果]制备的胶体金试纸对rPspA最低检测限达到0. 1pg/m L,可在15min内完成对肺炎链球菌的检测,与其他10种重要呼吸道病原菌无交叉反应;试纸条在25℃条件下保存6个月仍具有良好的重复性和稳定性。[结论]PspA蛋白具有高度的表面暴露性和较强的抗原性,可作为Sp的检测标志物,以其抗体为基础制备的胶体金免疫层析试纸,适用于Sp菌感染的临床快速检测。     

基于Web of Science的阴道菌群研究现状和热点的可视化分析与展望

探索阴道菌群近10年来的研究现状并预测其发展趋势。

在Web of Science数据库中检索近10年阴道菌群相关的文献,运用可视化软件VOSviewer进行共词分析、文献耦合、合著分析等。

阴道菌群领域发文量呈整体上升趋势,目前的主要热点研究分为阴道菌群的多样性、传染病学、细胞生物和基因学、阴道菌群与生殖的关联四大方面。

文献可视化研究展现了阴道菌群的研究现状和发展趋势,为相关研究人员提供了借鉴。

     

两种乳杆菌联用在食蟹猴阴道的定植效率及其毒性分析

研究乳杆菌鼠李糖乳杆菌-格氏乳杆菌联用制剂(LACT)的定植效率, 评估其有效剂量在动物体内的急性和长期毒性。

在食蟹猴中进行2轮阴道定植试验, 通过检测阴道分泌物pH值和清洁度, 并分离鉴定分泌物中的乳杆菌, 确定乳杆菌联用制剂的定植率和定植剂量; 通过单次和多次阴道给药, 检测联用制剂对食蟹猴体质量、食量、生殖器官及生化指标等的影响, 检测联用制剂在体内的急性和长期毒性。

联用制剂在食蟹猴中连续阴道给药5 d后能成功定植, 改善阴道的微生态; 甲硝唑预处理能够提高定植效率和定植时间; 联用制剂对食蟹猴不具有急性和长期的毒性作用。

在动物模型中, 2种乳杆菌联用制剂对细菌性阴道病具有良好的治疗潜质。

     

成人化脓性脑膜炎患者脑脊液变化

分析成人化脓性脑膜炎患者脑脊液细胞、病原菌等的变化及其关系, 为该病的有效诊断、病情监测和针对性治疗提供参考。

对我院32例成人化脓性脑膜炎患者用药前后不同时期的脑脊液分别进行常规、生化与细胞学检测, 对检测结果进行统计分析。

与恢复期比较, 患者急性期时脑压、脑脊液白细胞总数与乳酸脱氢酶水平显著升高(均P < 0.05)。32例患者中, 15例脑脊液细菌培养呈阳性。典型菌与非典型菌感染者急性期脑脊液白细胞总数、小淋巴细胞、单核吞噬细胞和嗜中性粒细胞比例差异均有统计学意义(均P < 0.05)。

成人化脓性脑膜炎患者脑脊液变化显著, 脑脊液细胞学变化与感染类型相关, 可为个性化诊疗提供参考。

     

大气细颗粒物影响小鼠上、下呼吸道菌群结构

探讨影响人类健康的大气细颗粒物干扰小鼠上呼吸道和下呼吸道菌群定植及可能机制。

建立大气细颗粒物暴露的小鼠模型。BALB/c小鼠随机分为PM2.5暴露组和对照组, 每组10只。收集上呼吸道和下呼吸道灌洗液进行菌群测序分析, 并进行肺组织HE染色, 观察肺组织形态改变情况。

大气细颗粒物暴露小鼠, 破坏肺组织气血屏障结构。16S rRNA测序证实了上、下呼吸道微生态的组成因大气细颗粒物暴露而发生改变。明确了与细颗粒物暴露组相比较, 对照组的噬几丁质菌定植的丰度较高。

大气细颗粒物影响小鼠上、下呼吸道的微生态结构。研究发现的差异菌群改变将会成为新的肺损伤治疗的潜在菌群。

     

基于高通量测序分析哮喘小鼠呼吸道菌群的变化

通过高通量测序分析哮喘模型小鼠呼吸道菌群的变化情况。

将12只SPF级BALB/c雄性小鼠随机分为对照组和模型组, 每组6只。采用卵清蛋白致敏方法建立哮喘小鼠模型后, 进行支气管组织切片病理学观察, ELISA法检测血清IgE水平, 测定肺指数, 采集咽拭子后提取DNA行高通量测序分析。

与对照组比较, 模型组小鼠血清IgE水平明显升高(P < 0.05), 肺指数明显上升(P < 0.05), 可见支气管上皮粘膜有水肿, 少量淋巴细胞浸润, 平滑肌增生。模型组小鼠呼吸道菌群与对照组比较, 菌种丰度升高, 厚壁菌门较对照组减少(P < 0.05), 放线菌门和变形菌门增多(P < 0.05), 菌群结构有明显差异。

哮喘小鼠存在呼吸道微生态菌群失衡。

     

Development of Lateral-flow Immunoassay for WSSV with Polyclonal Antibodies Raised against Recombinant VP （19＋28） Fusion Protein

We have developed a sensitive and rapid lateral-flow immunoassay (LFIA) for WSSV, using colloidal gold as an indicator. The fusion protein, VP (19 28), was expressed in E. coli, purified and used to prepare polyclonal antibodies. The purified anti-VP (19 28) IgG were conjugated with colloidal gold. Unconjugated anti-VP (19 28) IgG and goat anti-rabbit IgG were immobilized on nitrocellulose membranes. After assembly, three groups (5 individual animals in each group) of shrimp samples were tested which included healthy, moribund and dead shrimps. For each group, three different tissues (body juices, gills and hepatopancreas) were tested at the same time. In parallel, all the samples were also analyzed using PCR for comparison. Out of 45 samples tested, 30 were detected as positive while 15 were classified as negative. The results of LFIA correlate with those obtained by the PCR analysis, indicating that these two detection methods have the same efficacy in the limited number of samples tested in this preliminary study.     

Development of lateral-flow immunoassay for WSSV with polyclonal antibodies raised against recombinant VP (19+28) fusion protein

We have developed a sensitive and rapid lateral-flow immunoassay (LFIA) for WSSV,using colloidal gold as an indicator.The fusion protein,VP (19+28),was expressed in E.coli,purified and used to prepare polyclonal antibodies.The purified anti-VP (19+28) IgG were conjugated with colloidal gold.Unconjugated anti-VP (19+28) IgG and goat anti-rabbit IgG were immobilized on nitrocellulose membranes.After assembly,three groups (5 individual animals in each group) of shrimp samples were tested which included healthy,moribund and dead shrimps.For each group,three different tissues (body juices,gills and hepatopancreas) were tested at the same time.In parallel,all the samples were also analyzed using PCR for comparison.Out of 45 samples tested,30 were detected as positive while 15 were classified as negative.The results of LFIA correlate with those obtained by the PCR analysis,indicating that these two detection methods have the same efficacy in the limited number of samples tested in this preliminary study.     

委内瑞拉马脑炎病毒重组抗原的制备纯化及其胶体金免疫层析检测方法的建立

目的:表达委内瑞拉马脑炎病毒E2重组蛋白,并结合胶体金免疫层析技术建立一种简便检测委内瑞拉马脑炎病毒特异性抗体的方法。方法:利用已经构建的表达E2抗原的工程菌, 用IPTG诱导, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过一系列条件的变性、复性、透析,所制抗原用以包被硝酸纤维素膜,利用胶体金标记和免疫层析技术,建立委内瑞拉马脑炎病毒快速检测方法。对该方法的敏感性、特异性和稳定性作出评价。结果:重组工程菌可表达分子质量为 40 kDa的目的蛋白, 纯化后的蛋白质经SDS-PAGE显示纯度达95%以上。建立的检测方法可在20 min内完成检测。对症状相似及近缘的其他病毒进行检测,均无非特异反应。试纸条在37℃下保存2周,检测结果不变。该方法与R&;D公司商品化的ELISA试剂盒灵敏度检测无明显差异;对92份阴性血清进行检测,两种检测方法的符合率为96.7%。结论:重组委内瑞拉马脑炎病毒蛋白产生的包涵体变性复性后生具有良好的重复性和稳定性, 可作为委内瑞拉马脑炎病毒多种检测方法的抗原原料。胶体金免疫层析法具有快速、灵敏、特异、稳定的特点,适用于现场检测。     

基于N蛋白单克隆抗体的小反刍兽疫病毒抗体检测胶体金试纸条的研制

本研究旨在建立一种简便、快捷、可直观检测小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)抗体的检测方法。将pET-32a-N重组质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,以纯化的PPRVN蛋白免疫8周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)筛选及亚克隆,获得了抗PPRV N蛋白的单克隆抗体。将PPRV N蛋白分别作为金标抗原及检测线(T线)包被抗原、单克隆抗体作为质控线(C线)包被抗体,组装成检测PPRVN蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条。结果显示：成功获得1株能稳定分泌抗N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为1F1;间接ELISA检测1F1腹水效价为1:128000;亚类鉴定结果为IgG1,轻链为kappa链。Westernblotting结果显示,1F1能与PPRV N蛋白特异性结合;间接免疫荧光(indirect immunofluorescent ass...     

土拉弗朗西斯菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立

目的建立胶体金免疫层析技术快速定量检测土拉弗朗西斯菌。方法利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立土拉弗朗西斯菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合检测曲线进行定量检测。在面粉、饼干、果冻、梨汁等食品样品中添加土拉弗朗西斯菌的FopA蛋白模拟污染样品,评价该方法对固体、半固体、液体等食品样品的检测能力。结果该法可在10min内完成定性和定量检测,灵敏度为750ng／ml,线性范围750～24000ng/ml、回收率为56．7％-89．2％。结论所建立的检测土拉弗朗西斯菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的土拉弗朗西斯菌,适用于现场快速检测。     

Comparison of electrochemical immunosensors based on gold nano materials and immunoblot techniques for detection of histidine-tagged proteins in culture medium

In this work, the direct electrochemical determination of poly-histidine tagged proteins using immunosensor based on anti-His (C-term) antibody immobilized on gold electrodes modified with 1,6-hexanedithiol, gold colloid particles or gold nanorods is described. The recombinant histidine-tagged silk proteinase inhibitor protein (rSPI2-His(6)) expressed in Pichia system selected as antigen for this immonosensor. An electrochemical impedance spectroscopy was used as label free detection technique for immune conjugation. The gold nanorods modified electrode layer showed better analytical response than gold nano particles. The linear calibration range was observed between 10pg/ml and 1ng/ml with limit of detection 5pg/ml (S/N=3). Up to four successive assay cycles with retentive sensitivity were achieved for the immunosensors regenerated with 0.2M glycine-HCl buffer, pH 2.8. The performance of this immnosensor were compared with immuoblotting techniques.     

Rapid detection of glycyrrhizin by immunochromatographic assay

An immunochromatographic assay was developed for detecting glycyrrhizin (1). The qualitative assay is based on a competitive immunoassay using anti-1 monoclonal antibody (MAb) and a detector reagent that contains colloidal gold particles coated with anti-1 MAb. The immunochromatographic strip test, which has a detection limit of 250 ng/mL, is useful as a rapid screening method for detecting glycyrrhizin in plants, biological fluids and food samples.     

On Optical Properties of Dilute Colloidal Gold

Wavelength-dependent complex effective refractive index of dilute colloidal gold, i.e., spherical gold nanoparticles in water was measured using a reflectometer and a spectrophotometer. The spectral data obtained was used for the calculation of the wavelength-dependent complex permittivity of the gold nanoparticle with the aid of the Maxwell Garnett effective medium model for the colloid. It is shown that the wavelength-dependent complex permittivity of gold nanoparticle is different from the complex permittivity of bulk gold. Furthermore, Smakula’s formula is introduced for the calculation of the relative concentration of gold nanoparticles embedded in liquid using absorption data of the colloid.     

应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1，HIV-2 IgG抗体

应用斑点金免疫渗滤试验(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)建立了一种同步快速检测四种抗HIV-1/2IgG抗体的HIV诊断试纸。通过基因工程技术在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白片段(P24,GP41,GP36,GP120V3,GP120C)。这5种抗原蛋白首先被固定在硝酸纤维素膜上,然后滴加待测血清,其中的病毒抗体通过免疫反应与抗原结合,再加胶体金标记的葡萄球菌蛋白A(SPA),待其渗过膜片后,洗涤,即可形成肉眼可见的红色斑点。用已确证的21份HIV阳性血清(其中包括1份HIV-1标准阳性血清和1份HIV-2标准阳性血清)和30份阴性血清进行了试验,结果表明该快速检测方法与ELISA方法无显著差异。该检测方法不需任何仪器,仅凭肉眼即可判定结果,整个检测过程不超过5分钟。与传统的的ELISA法相比,具有方便快速,成本低廉,应用范围广等优点。同时,此HIV快速诊断试纸可以同步检测并区分针对HIV-1和HIV-2感染的不同检测标志物(抗P24、GP41、GP120和GP36抗体),这对提高快速检测的灵敏度和准确性,以及对判断HIV感染者是否临近或已进入AIDS期有着较高的应用价值。     

心肌型脂肪酸结合蛋白胶体金检测试纸条的制备和初步应用

目的应用胶体金免疫层析法制备检测全血或血清样本中心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的检测试纸条,用于急性心肌梗塞（AMI）的早期辅助诊断。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体,喷于玻璃纤维膜上制成胶体金结合物垫,将另一株鼠抗心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和抗鼠二抗分别包被检测线和质控线,组装成试纸条进行灵敏性、特异性、精密性、稳定性及临床样品检测。结果该试纸条的检测灵敏度为10ng／mL,15min内可判定结果;与肌钙蛋白I、C反应蛋白、肌酸激酶、人心肌肌红蛋白无交叉反应。检测240份临床标本,与临床诊断结果进行配对分析,阳性符合率95．83％、阴性符合率100％、总符合率97．92％。结论制备的H-FABP检测试纸条有良好的灵敏性、特异性,可用于早期AMI的辅助诊断。