人表皮生长因子(EGF)与单核-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合蛋白在大肠杆菌中的表达

应用基因工程技术,将ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ基因克隆到ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）载体的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ位点上,在大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明ＥＧＦ－ＧＭ－ＣＳＦ融合蛋白获得表达,并且具有ＥＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的免疫学活性．这为进一步研究该融合蛋白的功能和肿瘤治疗提供一种新的基因产品．     

pGEX-L系列表达载体的构建

对ｐＧＥＸ系列表达载体的多克隆位点（ＭＣＳ）进行了改造,改造前ＭＣＳ上仅有ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＩ三个酶切位点。改造后的ＭＣＳ上含有８个酶切位点,它们分别是ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＡｖａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌⅡ、ｐｓｔⅠ、ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ,改造后构建形成的ｐＧＥＸ－Ｌ系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

2,5—KDG还原菌Ⅱ基因的克隆和在大肠杆菌中的表达

参照文献上的２,５－二基－Ｄ－葡萄糖酸还原酶Ⅱ基因序列,合成两个引物序列并在两端加上ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ两个酶切位点,抽提棒状杆菌ＳＣＢ３０５８菌株的染色体灯反进行ＰＣＲ反应,克 得到２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因,酶切验民预期的结果相符合。将此片段克隆到ＰＧＥＭ－Ｔ载体上保存将２,５－ＤＫＧ还原酶Ⅱ基因用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨＩｍ内切酶切下,连接到ＰＢＶ２２０载体上,构建成表达载体,４２℃诱导不能得     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

rhGM—CSF／LIF融合蛋白基因的克隆及表达

利用基因重组技术,人工构建了一个编码五肽Ｇ－Ｓ－Ｇ－Ｇ－Ｓ的基因接头,将ＧＭ－ＣＳＦ和ＬＩＦ的ｃＤＮＡ相连而构成融合基因,将融合基因载入原核表达载体ｐＢＶ２２０后转化大肠杆菌,经热诱导后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹反应鉴定证实获得ｒｈＧＭ－ＣＳＦ／ＬＩＦ融合蛋白（简称ｒｈｇＭ－ＬＩＦ）活性测定表明重组的融合蛋白具有两因子双重活性。     

麦迪霉素4″—O—丙酰基转移酶（mpt）基因结构的研究

对含有麦迪霉素４″－Ｏ－丙酰基转移酶（ｍｐｔ）基因的ＢａｍＨＩ－ＢａｍＨＩ８．０ｋｂ的ＤＮＡ片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有２１个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因（ＣａｒＥ）的２．４ｋｂ ＤＮＡ片段为探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交,将ｍｐｔ定位于一个ＥｃｏＲＩ－ＥｃｏＲＩ－ＰｓｔＩ３．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上,将该片段克隆至大肠杆菌／链霉菌穿梭质粒载体ｐＷＨＭ３     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

双抗（抗病毒及抗虫）植物表达载体的构建及番茄的化鉴定

将抗病毒的ＣＭＶ－ｃｐ基因和抗虫的Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因依次插入到植物表达载体ＰＥ３的ＨｉｎｄⅢ和ＫｐｎⅠ位点,通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定,然后以土壤农杆菌ＧＶ３１１－ＳＥ介导转化番茄,胭脂碱检测,染色体ＤＮＡ的点杂交及ＰＣＲ扩增证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已同时导入转化再生的番茄植株。ＲＮＡ点杂交证明ＣＭＶ－ｃｐ基因和Ｂｔ－ｔｏｘｉｎ基因已在转基因番茄植株中同时获得表达。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的 …

以ＰＲＲＳＶ弱毒株膜蛋白（Ｍ）和核衣壳（Ｎ）蛋白基因为模板,设计的一对含有ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点的引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一约９００ｂｐ的ＭＮ基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐＢＶ２２０,构建成重南粒ｐＢＶＭＮ,导入大肠杆菌ＤＨ５α,经温敏诱导,成功地表达了ＭＮ基因。表达产物经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ印迹分析,其分子量约３４ｋＤ,与兔抗ＰＲＲＳＶ高兔血清     

FEN—1基因反义阻断细胞株（FL—FEN—1^—）的建立

ＦＥＮ－１是一咱结构特异性核酸酶,它在ＤＮＡ复制和修复过程中都起着重要的作用。将ＦＥＮ－１基因的ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ片段反向克隆到哺乳动物细胞重组表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－中,得到ＦＥＮ－１反义表达质粒ｐＭＡＭｎｅｏＡｍｐ＾－ＦＮＢ＾－,并转染ＦＬ细胞,经Ｇ４１８筛选后,获得ＦＥＮ－１基因表达被阻断的哺乳动物细胞ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－。对细胞生长曲线的测定发现,ＦＬ－ＦＥＮ－１＾－在地塞米松的     

重组人MCAF／GM－CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）进行基因融合,置于ｐＢＶ２２０载体的λＰＲＰＬ串联启动子下游,构建了ＳＤ序列与ＡＴＧ之间含有不同核苷酸组成的重组质粒ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３。ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但ＤＨ５α（ｐＭＧ０２、ＤＨ５α（ｐＭＧ０３）的表达水平远远高于ＤＨ５α（ｐＭＧ０１）,ＤＨ５α（ＰＭＧ０１）几乎没有表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,它能分别与ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持ｈＧＭ－ＣＳＦ依赖的ＴＦ１细胞生长的特性,说明ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ的生物学功能是相容的．     

用T—A载体克隆技术构建丙肝病毒C＋E1区真核表达质粒pSVL—HC…

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ将丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１ＤＮＡ片段从其克隆载体ｐＧＥＭ３ｚｆ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１上切下,经Ｔｘｑ酶补齐３‘末端后插入到载体ｐＳＶＬ－Ｔ中,构建成丙肝病毒Ｃ＋Ｅ１真核表达载体ｐＳＶＬ－ＨＣＶ／Ｃ＋Ｅ１。     

嗜麦芽假单胞菌酪氨酸酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

酪氨酸酶基因（ｍｅｌ）编码的酪氨酸酶是合成黑色素的关键酶。用鸟枪法分离嗜麦芽假单胞菌的ｍｅｌ基因：以ｐＵＣ１８为载体,Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１为受体菌,在加有一定量的Ａｍｐ和Ｌ－ｔｙｒ的酪素平板上筛选到分泌可溶性黑色素的转化子,所含重组质粒ｐＷＳＹ约７００ｂｐ的外源ＤＮＡ片段上携有ｍｅｌ基因,该片段无ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｃｌＩ等酶的识别位点。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实此片段确实     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

转化生长因子α—绿脓杆菌外毒素融合蛋白TGFa—PE40高效表达质…

利用基因工程技术,将质粒ＰＹＸ３８２用ＸｂａＩ和ＥｃｏＲＩ切下插入的ＴＧＦａ－ＰＥ４０融合基因片段,连接到可表达载体ＰＣＢ６０４的ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ位点中,构建成新的重组质粒Ｐ２Ｘ－ＴＰ１。Ｐ２Ｘ－ＴＰ１转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１感受态菌后,在ＩＰＴＧ诱导下Ｉｐｐ启动子转寻表达ＴＧＦａ－ＰＥ４０融合蛋白。表达产生物主要以包涵体形式沉积在细胞内,隔合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及     

用PCR扩增和克隆鸡传染性贫血病毒全基因组DNA

根据已发表的序列,分别在鸡贫血病毒（ＣＡＶ）环形基因组ＤＮＡ（全长２．３ｋｂ）的ＥｃｏＲＩ位点和ＢａｍＨＩ位点的两侧选择适当序列合成两对引物,用ＰＣＲ技术,从斑点杂交检测到病毒核酸的ＣＡＶ感染的ＭＤＣＣＲＰ１细胞基因组ＤＮＡ中,分别扩增出包含ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ分割开的病毒基因组两部分（１．５ｋｂ和０．８ｋｂ）约１．５ｋｂ和约１．２５ｋｂ的两个片段。再将其中相应序列拼接克隆进ｐＵＣ１８载体,获得包含ＣＡＶ全基因组序列ＤＮＡ片段的克隆质粒ｐＣＡＶ２．４。酶切分析表明,该质粒具有预期的ＢａｍＨＩ位点、ＰｓｔＩ位点、ＨｉｎｄⅢ位点,而预期的ＥｃｏＲＩ位点消失。重组质粒插入ＤＮＡ片段的两端序列分析表明,质粒ｐＣＡＶ２．４是包含ＣＡＶ全基因组序列的重组质粒,插入ＤＮＡ片段序列中的ＥｃｏＲＩ位点序列发生了一个碱基突变。     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．