人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性

为了研制人乳头瘤病毒16型(HPV16)防治性疫苗,分析了HPV16 E5与IL-12联合基因疫苗的免疫活性。将构建的pcDNA3.1(+)/E5与pcDNA3.1(+)/IL-12联合免疫BALB/c小鼠,以ELISA测定小鼠血清中抗HPV16 E5 IgG水平、小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量;MTT法检测脾淋巴细胞增殖反应。结果显示末次免疫后,联合基因疫苗组和单基因疫苗组血清IgG A450值分别明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组的IFN-γ和IL-4含量分别均明显高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组IFN-γ和IL-4含量(P<0.01),且联合基因疫苗组含量显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别显著高于pcDNA3.1(+)组、pcDNA3.1(+)/IL-12组和PBS组(P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。     

HPV6L1/CtMOMP多表位融合基因在COS-7细胞的表达及其在小鼠的免疫效果观察

研究人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b结构蛋白L1(HPV6b L1)基因佐剂增强沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)主要外膜蛋白(MOMP)多表位(Ct MOMP168)DNA疫苗的免疫效果的可能性.构建pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168融合重组质粒,转染COS-7细胞,用RT-PCR、激光共聚焦显微技术及Western印迹技术检测其表达.分别用pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/Ct MOMP168、pcDNA3.1(+)/Ct MOMP168及pcDNA3.1(+)质粒肌肉免疫BALB/c小鼠,ELISA检测外周血中IgG及阴道分泌物中sIgA.结果表明,pcDNA3.1(+)/HPV6b L1/CtMOMP168可在COS-7细胞中表达;Ct MOMP168组和HPV6b L1/Ct MOMP168组均可刺激小鼠产生抗Ct MOMP特异性的抗体,抗体滴度随免疫次数增加而升高,且HPV6b L1/Ct MOMP168组小鼠产生的抗体滴度明显高于Ct MOMP168组(P0.05).结果提示,分子佐剂HPV6b L1与CtMOMP多表位基因融合能够显著增强Ct MOMP多表位DNA疫苗的体液免疫应答.     

人前胰岛素原基因裸质粒DNA肌肉注射可显著降低链脲佐菌素诱发糖尿病小鼠的血糖水平

通过基因治疗的方法补充胰岛素已用于实验性治疗胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)。本研究构建了含有重组人前胰岛素原基因的棵质粒DNA载体(pCMV—IN),将其肌肉注射入链脲佐菌素(STZ)诱发的糖尿病C57小鼠体内,并辅以电穿孔方法,以获得在体胰岛素转基因治疗。该质粒载体表达的胰岛素mRNA,可通过RT—PCR方法在转基因局部的骨骼肌组织中检测到。在接受pCMV—IN注射的糖尿病小鼠中,血浆胰岛素水平显著升高,达到了未注射STZ的正常对照小鼠的水平,且胰岛素的表达可持续至少35d。pCMV—IN质粒注射转基因治疗显著降低了糖尿病小鼠在第7至35d的血糖水平,其下降幅度约6mmol／L;转基因治疗也显著降低了严重糖尿病小鼠的死亡率,其第6周时的死亡率由100％降为37％。结果表明,直接肌肉注射含人前胰岛素原基因裸质粒可获得胰岛素的有效表达,显著降低糖尿病小鼠的血糖水平并降低严重糖尿病小鼠的死亡率。裸质粒注射胰岛素转基因治疗有望成为IDDM的一种有效治疗手段。     

流体力学注射IL-35质粒对ConA诱导小鼠肝损伤的保护作用

目的:观察流体力学注射白细胞介素35(IL-35)质粒对刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠肝损伤的干预效果。方法:通过流体力学注射将pcDNA3.1-IL-35导入C57BL/6小鼠体内,对照组注射pcDNA3.1。24h后,以ConA(15mg/kg)尾静脉注射建立小鼠肝损伤模型,检测血清ALT活性和肝组织病理变化。结果:流体力学注射pcDNA3.1-IL-3524h后,肝组织有IL-35mRNA和蛋白的表达。与对照组相比,pcDNA3.1-IL-35预处理组小鼠血清ALT水平明显降低,肝组织病理损伤明显减轻。结论:流体力学注射IL-35质粒对ConA诱导的小鼠肝损伤具有保护作用。     

骆驼蓬脂转移蛋白基因真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应的研究

目的:构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法:将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P0.01)。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P0.05)。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P0.01)。结论:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。     

聚乙烯亚胺增强Pluronic介导的BALB/c小鼠骨骼肌原位基因传递和表达效率

目的在Pluronic L64介导的BALB/c小鼠骨骼肌基因传递体系中正确引入聚乙烯亚胺(PEI)以增强基因表达效率。方法以生理盐水组、质粒DNA (p DNA)组和Pluronic L64/p DNA (L/D)组为对照组,各比例PEI/p DNA与Pluronic L64混合物(L/P/D-0. 5、L/P/D-3、L/P/D-10)为实验组,将各组样品注射到小鼠胫骨前肌中。7 d后取组织,检测报告基因表达(β-半乳糖苷酶和荧光素酶)和肌肉组织病变情况。通过尾静脉注射考察L/P/D-0. 5组的体内急性毒性。最后,通过动态光散射仪和原子力显微镜测定L/P/D-0. 5组中PEI/p DNA复合物的粒径、电位及形貌。结果 1)报告基因表达评估:L/P/D-0. 5组外源基因表达效率最高;随着N/P增加,几乎检测不到外源基因的表达。2)生物相容性评估:无论原位注射还是尾静脉注射,L/P/D-0. 5组均没有显示出组织病变,而其他比例的L/P/D组出现了不同程度的组织学病变。3)物理特征表征:虽然在L/P/D-0. 5组中DNA未被完全压缩,但PEI/p DNA复合物已拥有良好的纳米粒径和形态结构,且表面电位为负。结论 L/P/D-0. 5体系能安全有效地增强外源基因在骨骼肌内的表达。     

pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒构建及其在人成骨样细胞SaOS-2细胞中的表达*

目的:构建结缔组织生长因子(CTGF)的pcDNA3.1(+)真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-CTGF),并检测其在人成骨样细胞SaOS-2中的表达,为进一步研究CTGF基因在骨发育和骨修复中的机制提供技术支撑。方法:采用PCR方法体外克隆CTGF基因全序列,将其用同源重组技术连接到线性pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并对该质粒进行测序鉴定;鉴定无误后转染至SaOS-2细胞中,观察其48 h的表达情况。结果:基因测序证实pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达重组质粒构建成功,与对照组相比,转染SaOS-2细胞48 h后的CTGF表达水平显著上调,达到对照组的4.8×10⁵倍(P＜0.01)。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-CTGF真核表达质粒,并能在人成骨样细胞SaOS-2中稳定表达,为深入研究CTGF基因对骨生成的调控机制奠定了基础。     

表达CRT/E7融合蛋白的人乳头瘤病毒DNA疫苗对肿瘤生长和血管生成抑制作用的研究

研究HPV6b E7/CRT DNA疫苗免疫保护,清除已有感染和相关肿瘤细胞及其血管生成抑制作用,分析CRT抗血管生成的功能片段,为筛选高效的HPV疫苗提供实验依据。用重组质粒pcDNA3.1( )-GFP-CRT120/HPV6bE7、pcDNA3.1( )-GFP-HPV6bE7、pcDNA3.1( )-GFP-CRT120、pcDNA3.1( )-GFP-CRT180/HPV6bE7、pcDNA3.1( )-GFP-CRT180通过肌内注射途径免疫C57BL/6小鼠。Matrigel法进行抗血管活性检测;B16/HPV6bE7细胞接种于C57BL/6雌性小鼠建立荷瘤模型,观察各组DNA疫苗对HPV6bE7基因的荷瘤组织的出瘤时间和肿瘤大小的影响。结果显示:重组DNA疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6bE7和pcDNA3.1-CRT180在动物体内能对bFGF诱导的新生血管的生成有明显的抑制作用;CRT180/HPV6bE7和CRT180能显著抑制荷瘤的大小且CRT180/HPV6bE7免疫组较其他组能明显延缓荷瘤的形成时间、生长速率以及肿瘤重量。CRT180/HPV6bE7免疫组较其他组能诱导更强的血管抑制作用和部分抑制肿瘤生长,推测抑制血管的功能片段存在于CRT 120~180 aa片段上。     

小鼠可溶性PD1的克隆、真核表达及生物学活性检测

旨在克隆小鼠PD1胞外区(简称mPD-1)基因,利用真核表达系统表达有活性的分泌型mPD-1蛋白,初步研究其生物学活性。克隆mPD-1基因,将其连入pcDNA3.1(+)/Fc中获得pcDNA3.1(+)-Fc/mPD-1重组表达质粒,转化至大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并送测序。将阳性质粒转染L929细胞,利用RT-PCR和Western blotting方法鉴定mPD-1/L929稳定表达株。利用Alamar Blue法检测分泌的mPD-l蛋白对淋巴细胞增殖的影响,评价其生物学活性。结果显示,成功构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Fc/mPD-1,转染了pcDNA3.1(+)-Fc/mPD-1的L929细胞可将mPD-l蛋白分泌至胞外。A lamar Blue检测结果显示,真核细胞分泌的mPD-1蛋白作用于混合淋巴细胞,与阴性对照相比,可明显促进淋巴细胞的增殖。本试验成功地克隆mPD-1胞外区蛋白,并在L929细胞中得到了分泌型表达。分泌的重组蛋白可有效促进淋巴细胞增殖,为进一步研究其功能和临床应用提供了条件。     

长链非编码RNA 1500026H17Rik对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖的影响

为了探讨长链非编码RNA 1500026H17Rik对小鼠肾小球系膜细胞增殖的影响,采用qRT-PCR(quantitative Real-time PCR)检测1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织及在高糖和低糖条件下培养的肾小球系膜细胞中的表达水平;扩增小鼠1500026H17Rik的全长序列,将其克隆到pcDNA3.1(+)载体上,构建pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒,并设计合成si RNA;将1500026H17Rik-si RNA和pcDNA(+)-1500026H17Rik过表达质粒分别转染至高糖或低糖培养的肾小球系膜细胞中,通过5-乙基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethyny1-2′-doexyuridine,Ed U)检测肾小球系膜细胞的增殖能力。结果表明,在糖尿病肾病小鼠肾脏组织和高糖培养的系膜细胞中1500026H17Rik表达水平显著提高。在低糖培养的系膜细胞中转染pcDNA3.1(+)-1500026H17Rik过表达质粒后与低糖培养的系膜细胞或空质粒转染对照组相比,低糖1500026H17Rik过表达的肾小球系膜细胞的增殖能力明显提高。同时,将通过qRT-PCR筛选出的一条敲低效率最佳的1500026H17Rik-si RNA转染至高糖培养的系膜细胞后,与高糖培养的系膜细胞或si RNA转染对照组相比,1500026H17Rik敲低的肾小球系膜细胞的增殖能力明显减弱。lnc RNA-1500026H17Rik在糖尿病肾病小鼠肾脏组织中呈高表达,且影响高低糖培养的肾小球系膜增殖,提示1500026H17Rik可能参与了糖尿病肾病的发生。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Principles of organization and evolution of systems of regulation of functions

Evolution of living organisms is closely connected with evolution of structure of the system of regulations and its mechanisms. The functional ground of regulations is chemical signalization. As early as in unicellular organisms there is a set of signal mechanisms providing their life activity and orientation in space and time. Subsequent evolution of ways of chemical signalization followed the way of development of delivery pathways of chemical signal and development of mechanisms of its regulation. The mechanism of chemical regulation of the signal interaction is discussed by the example of the specialized system of transduction of signal from neuron to neuron, of effect of hormone on the epithelial cell and modulation of this effect. These mechanisms are considered as the most important ways of the fine and precise adaptation of chemical signalization underlying functioning of physiological systems and organs of the living organism