易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征

目的研究不同条件下、不同生长期易致污染的支原体在固体培养基中的形态特征。方法通过改变支原体菌体浓度、培养时间及培养基组成,观察支原体在固体培养基中的形态变化。结果支原体菌体浓度小于103cfu/m L时,培养至2~3天后可在固体培养基中形成典型的"油煎蛋"状形态,以蔗糖作为碳源培养支原体会导致葡萄糖发酵型支原体(肺炎支原体)不能在固体培养基中形成典型菌落,当使用牛血清代替马血清为支原体提供外源胆固醇时,猪鼻支原体在固体培养基中不能形成典型菌落。结论支原体的不同生长期、菌体浓度、培养基的组成都会使易致污染的支原体在固体培养基上的形态发生变化。     

不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。     

大肠杆菌感受态细胞培养与冻存条件的研究

测定大肠杆菌JM107在37℃培养条件下的生长曲线,制备其对数生长期不同阶段感受态冻存细胞,并对冻存细胞的转化率进行研究。结果显示：分离良好的单个新鲜菌落接种于50mlSOB培养基,经37℃,170～180r/min振荡培养210min左右,所得冻存细胞转化率最高,－7O℃保存时可达5．2×10⁷转化子／μgDNA且感受态保持时间长,即使存放两个月仍能保持相当高的转化率。－20℃保存时也能在三周内保持较高转化率。     

用Ciprofloxacin去除传代细胞株中的支原体污染的研究

在应用细胞培养手段的生物学研究和生物工程产品中,支原体污染仍是一个非常棘手的问题。对Ｖｅｒｏ和ＳＰ２／０－Ａｇ１４等细胞,应用Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ,１０μｇ／ｍｌ处理１４天,支原体检测全部转阴,经４个月的培养、传代、冻存、复苏,每次支原体检测均保持阴性。对去除了支原体的Ｖｅｒｏ和ＩＳＣ－１１６细胞株,测试了其生长特征和功能,均未见受影响。     

BALB/C小鼠杂交瘤细胞冻存初探

自从Polge(1949)用甘油作为保护剂成功的冻存了Hela和L细胞以来,细胞冻存技术已日趋完善。本文对细胞株的冻存分别采用-70℃冰箱和常用的液氮深低温的方法。定期复苏,测定抗体效价,最后作染色体比较,至今已一年多,其结果令人满意。现将结果简要报告如下。方法1.细胞冻存:选择生长旺盛期,形态良好的细胞,按每ml细胞冻存液内含活细胞约1×106个,每支冻存管1ml。细胞冻存管置-20℃冰箱内15小时左右,分别放入液氮和-70℃冰箱内。经不同时期后取出作复苏及抗体效价比较。2.细胞复苏:取出冻存管,迅速浸入37℃水浴中,在1分钟内解冻后转种到已预制…     

产毒金黄色葡萄球菌鉴定及在百叶中生长与产毒特性分析

从生鲜食品中分离鉴定得到产肠毒素SEA的金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）菌株,研究金黄色葡萄球菌在百叶中的生长变化及产肠毒素特性。将不同浓度的金黄色葡萄球菌同时接种到减菌（样品组）和未减菌（对照组）百叶中,高、低初始接种量分别控制在4.0 lg(cfu/g)和2.0 lg(cfu/g)左右,并定时追踪不同储存温度条件下百叶中金黄色葡萄球菌的活菌数及产毒情况。金黄色葡萄球菌肠毒素的检测采用商业化的ELISA试剂盒。在37 ℃储存过程中,金黄色葡萄球菌在样品组中不但能生长良好并在18 h后菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)并被检测出肠毒素,对照组中金黄色葡萄球菌生长良好菌落数可达到7.0 lg(cfu/g)却未检测出产肠毒素。在25、15和5 ℃储存过程中,样品组和对照组百叶都未检测出肠毒素。温度对金黄色葡萄球菌在百叶中是否产肠毒素具有决定性的作用,且百叶中本身存在的杂菌可能可以抑制金黄色葡萄球菌产肠毒素。     

人胚胎干细胞程序降温保存的实验研究

本文采用升降式程序降温仪对人胚胎于细胞进行了程序降温保存,并探讨和比较了降温速率、置核温度、保护剂和投入液氮前温度对冻存复苏后胚胎干细胞的存活率、活力及分化特性的影响。结果表明:采用Me_2SO 血清 DMEM(体积比为1∶3∶6)的保护剂,从0℃开始,以0.5℃/min的速率对细胞悬液降温;至-10℃时对其进行置核,并于-35℃时将其快速投入液氮中保存,复温后效果最佳。冻存复温后细胞存活率可达81.8%,复苏后的胚胎干细胞形态和集落生长方式都与冻前的生长形态相同,且胚胎干细胞标志之一碱性磷酸酶(AKP)反应阳性,同时染色体组型仍正常。     

胚脑神经元冻存和培养的研究进展

影响胚脑神经元冻存效果的关键因素有:冷冻保护剂及其浓度、降温和复温速率、储存温度等。以10％DMSO作为冷冻保护剂,以接近1—2℃/分的速率降温,37℃水浴中快速复苏,储存在液氮中,能较好的保证冻存神经元的存活率。冻存的胚脑神经元,培养后继续存活的细胞数比未经冻存的明显减少,但生长、分化情况却无显著差别,仍保持了神经元的形态学特征和特异性酶的表达及递质合成的功能,并能在宿主脑内继续生长、发育、发生整合。     

麻杏石甘汤合玉屏风散对支原体肺炎患儿血清炎症因子、氧化应激及T淋巴细胞亚群的影响

目的:探讨麻杏石甘汤合玉屏风散对支原体肺炎患儿血清炎症因子、氧化应激及T淋巴细胞亚群的影响。方法:选取我院儿科门诊于2016年12月至2018年7月间收治的86例支原体肺炎患儿,按随机数字表法分为观察组(43例)和对照组(43例)。对照组采用常规治疗,观察组在对照组基础上联合使用麻杏石甘汤合玉屏风散治疗,两组均治疗14 d。比较两组患儿疗效及临床症状变化情况,检测并比较两组患儿血清炎症因子、氧化应激指标和T淋巴细胞亚群变化情况,观察两组患儿治疗过程中的不良反应发生情况。结果:观察组总有效率为93.02%(40/43),高于对照组的76.74%(33/43)(P<0.05)。观察组患儿体温恢复时间、啰音消失时间、咳嗽消失时间和X线检查恢复正常时间均明显短于对照组(P<0.05)。治疗14 d后,两组患儿血清白介素-2(IL-2)水平明显升高,而白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平明显降低(P<0.05);且与对照组比较,观察组患儿治疗14 d后的血清IL-2水平明显较高,而IL-4、IL-6和TNF-α水平明显较低(P<0.05)。与治疗前比较,治疗5 d后、治疗14 d后,两组患儿血浆丙二醛(MDA)降低,超氧化物歧化酶(SOD)水平升高(P<0.05);与对照组比较,观察组治疗5 d后的血浆MDA明显较低,而SOD水平明显较高(P<0.05)。治疗14 d后,两组患儿CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺明显升高,且观察组高于对照组,而两组患儿CD8⁺明显降低,且观察组低于对照组(P<0.05)。两组不良反应比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:麻杏石甘汤合玉屏风散治疗支原体肺炎疗效显著,能够缓解临床症状、炎症反应,减轻患儿氧化应激状态,并可提高患儿免疫功能。     

改良DNA染色法对支原体检测的效果评估

目的 评估改良的DNA染色法检测支原体的效果。方法 使用无水乙醇为固定液和DAPI为荧光染料进行改良的DNA染色法,通过改变细胞接种浓度、细胞培养时间、接种支原体的浓度以及接种猪鼻支原体、口腔支原体和精氨酸支原体,观察支原体污染细胞进行DNA染色后的效果变化。结果 Vero细胞接种浓度在1.0×10⁵个/mL时,DNA染色效果最好;支原体在传代培养5 d后进行DNA染色效果更好;接种支原体污染的细胞上清,胞核外有较少的蓝色荧光,而接种支原体污染的细胞培养物的胞核外可见大量的蓝色荧光;猪鼻支原体的DNA染色效果比口腔支原体和精氨酸支原体的DNA染色效果好。结论 改变细胞接种浓度、细胞培养时间、支原体浓度以及种类,都能观察到不同的DNA染色结果,从而证明改良的DNA染色法也能用于支原体DNA染色检查。     

肺炎链球菌C多糖含量检测方法的建立

目的使用肺炎链球菌C多糖单克隆抗体(单抗),建立检测荚膜多糖中残留的C多糖含量的方法。方法选择BALB/c雌性小鼠,采用体内诱生单抗腹水,放大生产肺炎链球菌C多糖单抗;使用间接ELISA、抑制性ELISA对其进行特异性鉴定;用特异性和亲和力高的单抗尝试建立肺炎链球菌荚膜多糖中C多糖含量检测的速率比浊法,并对该方法的线性、精密度、特异性进行验证。结果所制4株单抗的抗体类别均为IgM,识别的抗原表位互不相同,亲和力也不同。间接ELISA、抑制性ELISA结果均显示,所获得的单抗能够作用于肺炎链球菌C多糖上的磷酸胆碱位点,具有很好的特异性。选择单抗E8建立速率比浊检测方法的线性、精密度和特异性均良好,检测结果表明肺炎链球菌23个血清型荚膜多糖中C多糖含量不同。结论利用单抗建立了检测肺炎链球菌荚膜多糖中残留的C多糖的含量的速率比浊法。     

蛋白质类生物制品几种不合格冻干外观及解决方案

冻干即真空冷冻干燥,是利用升华的原理使物料脱水的一种干燥技术,其广泛用于生物制品,特别是蛋白质类生物制品的生产,以保护生物制品生物活性成分。外观是冻干制品的重要质量属性之一,合格的冻干制品外观应是疏松多孔、色泽均匀、质地细腻的固体。在大规模生产中,由于冻干参数复杂、设备操作的灵活性等因素,冻干制品的饼块有时会出现收缩、裂化、塌陷、雾化、回熔、喷瓶、结膜等不合格外观,从而造成极大的经济损失。现就近年来在蛋白质类生物制品冻干过程中易发生的几种不合格外观及解决方案作一概述。     

一种人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的瞬时表达及性质分析

目的瞬时表达人源重组抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对抗体性质进行分析。方法 PCR法扩增抗体轻、重链可变区并分别构建真核表达质粒;瞬时转染HEK293 EBNA1细胞;抗体经亲和纯化后,CE-SDS法分析纯化后抗体单体比例,用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分析抗体体外抗狂犬病病毒中和活性,ELISA分析抗体与3aG、CTN、PV及CVS株的结合。结果提取瞬时表达质粒的A260/280 nm比值在2.0～2.1之间纯化后抗体非还原CE-SDS单体纯度为74.4%;还原CE-SDS抗体轻、重链峰合计占比超过95%;抗体RFFIT体外中和活性为293.37 IU/mL,比活达628.21 IU/mg,抗体与3aG、CTN、PV及CVS株交叉反应均为阳性。结论该株抗体具有较高体外抗狂犬病病毒中和活性,与主要疫苗株均有较强结合。     

呼吸道合胞病毒F蛋白抗体的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染,是造成婴幼儿、学龄前儿童、免疫缺陷患者、老年人等高危群体住院治疗及死亡的重要病因。目前,多个预防RSV感染的候选疫苗正处于研发中,尚无安全、有效的疫苗面世。对RSV感染的处理仍以治疗为主,使用帕利珠单抗(Palivizumab)是当前仅有的预防药物。在过去数年间出现的新型抗体药物,如多克隆抗体、单克隆抗体、纳米抗体等有些已进入了临床前或I、II、III期临床试验阶段。融合蛋白(fusion protein,F蛋白)在RSV感染过程中是不可或缺的,它介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前构象状态(prefusion fusion protein,pre F)转变为热力学稳定的融合后状态(postfusion fusionprotein,post F)。近年来,研究人员通过不断筛选,获得了多株针对pre F的抗体。与结合post F的抗体相比,这些抗体具有更强的RSV中和活性。一些更新的抗体药物候选品,在实验中显示出了效力强、药代动力学特征明显、半衰期长等特点,并能以其他途径给药,而且能降低其制备成本。现就抗RSV pre F的抗体研究进展作一概述。     

有机溶剂/去污剂病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响

目的 探索用有机溶剂/去污剂(solvent/detergent, S/D)病毒灭活处理对破伤风抗毒素质量的影响。方法 3批破伤风抗毒素样品,每批样品取3等份,向其中2份中分别加入磷酸三丁酯(tri- n -butylphosphate, TNBP)和吐温-80(Tween 80)至终质量分数为0.3%和1%;一份放置在(25±1)℃水浴中振摇6 h后取样,另一份放置在(30±1)℃水浴中振摇4 h后取样;向第3份破伤风抗毒素原液中加入等量的生理盐水混匀后室温放置作为对照。各样品经超滤后检测其效价和蛋白质含量,同时用SDS-PAGE电泳和凝胶过滤色谱柱测定。结果 破伤风抗毒素原液样品经过S/D病毒灭活处理后,其动物效价与对照相比差异无统计学意义( P >0.05),蛋白质含量、分子大小分布无明显变化,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量也无明显变化。结论 S/D病毒灭活处理对破伤风抗毒素的效价,蛋白质含量,分子大小分布,多聚体、二聚体及F(ab′) 2含量均无明显影响,可以作为破伤风抗毒素病毒灭活的候选方法。     

消毒剂对环境菌株抑制作用的研究

目的 研究企业常用消毒剂对于洁净室环境监测分离的菌株样本的抑制作用。方法 通过VITEK2-COMPACT全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定收集到的环境菌株。对3种消毒剂(碘伏、无水乙醇和苯扎溴铵)进行梯度稀释,利用打孔法研究3种消毒剂在不同含量下对环境菌株的抑制作用。结果 共检出革兰阳性菌8种、革兰阴性菌2种、酵母菌1种、芽孢杆菌2种;苯扎溴铵对革兰阳性菌的抑菌能力都较强,随着含量的降低,抑菌作用逐渐减弱;碘伏对革兰阴性菌及酵母菌的抑制作用都非常强,随着含量降低,抑菌作用逐渐降低。3种消毒剂对2种芽孢杆菌的抑制作用均有限。结论 用1.00%苯扎溴铵和0.50%的碘伏抑菌作用都非常强。另外,应配合使用杀孢子剂,避免芽孢杆菌孢子在空气中传播。     

低pH孵放病毒灭活处理对马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2质量的影响

目的考察低pH孵放病毒灭活处理对马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2质量的影响。方法取马破伤风免疫球蛋白F(ab')_24份,分别调整pH至3.8、4.1、4.4及6.5,于(25±1)℃条件下放置21 d后取样测定抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量,评估低pH孵放病毒灭活法对上述质量指标的影响;以1 mL/瓶的规格分装经低pH孵放病毒灭活处理的马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2,于(25±1)℃条件下存放6个月,定期取样并进行抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量检测,评估其稳定性。结果马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2经低pH孵放病毒灭活后,其抗体效价、聚合物(二聚体、多聚体)及F(ab')_2含量未发生明显变化;样品于(25±1)℃条件下存放6个月后,抗体效价和F(ab')_2含量均符合《中华人民共和国药典》2015版(三部)的要求。结论低pH孵放病毒灭活法适用于马破伤风免疫球蛋白F(ab')_2病毒的灭活。     

基于线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ基因序列的细胞种属鉴别及细胞交叉污染分析

目的建立一种快速、简便、敏感和特异的基于线粒体细胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase subunit I,CoI)基因序列的细胞基质检测方法,用于细胞种属鉴别和不同种属间的细胞交叉污染分析。方法①提取非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、狗肾细胞(MDCK细胞)和牛肾细胞(MDBK细胞)基因组DNA,以PCR扩增相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因条码序列,将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测其基因片段的大小,并与文献报道的来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守区的基因条码序列片段大小进行对比,以确定细胞的种属类别;②用Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与相应细胞和其他不同种属的细胞的基因组DNA进行PCR扩增,检测方法的特异性;用不同浓度的细胞基因组DNA与相应细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物进行PCR扩增,检测方法的灵敏度;③以不同种属细胞的线粒体CoI基因保守区的基因的特异性引物分别与多种细胞混合液提取的细胞基因组DNA进行PCR扩增,检测细胞间的交叉污染。结果 Vero细胞、MDCK细胞及MDBK细胞线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小,与来源于ATCC相应细胞系线粒体CoI基因保守序列中的基因条码序列片段大小相符。该方法具备较好的特异性,检测灵敏度为1.0 ng/μL,不同种属间细胞的交叉污染可被检出。结论该方法可有效地判断细胞的种属来源,亦可用于不同种属间细胞交叉污染的分析。     

两种高危型HPV假病毒的构建及其在血清中和抗体测定中的应用

目的 构建人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)16型(HPV16)和18型(HPV18)假病毒,探索优化假病毒制备的条件,并利用制备的假病毒评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。方法 将优化后的HPV16和HPV18 L1、L2和EGFP基因片段分别插入pcDNA3.1+载体中,通过多质粒共转染293FT细胞制备假病毒。对转染试剂、多质粒共转染比例、转染时间和细胞裂解时间进行摸索优化,通过测定假病毒的滴度,确定假病毒制备的最佳条件。收获的假病毒用30%的碘克沙醇作为介质进行超速离心纯化,纯化后的假病毒用于电镜观察。利用假病毒中和试验对制备的原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清以及HPV16和HPV18病毒样颗粒(virus-like particles, VLP)免疫血清进行中和活性评价。结果 成功构建了假病毒,并确定了假病毒制备的最佳条件:pL1∶pL2∶pEGFP等3种质粒共转染比例为1∶0.1∶0.5,总量为4μg;转染时间为72 h,细胞裂解时间为24 h时获得的假病毒滴度最高。透射电镜观察结果显示,HPV16和HPV18假病毒颗粒基本呈规则圆形,形态上与天然病毒颗粒相似。中和试验结果显示,当用原核表达复性蛋白HPV16 L1免疫血清中和HPV16假病毒时,并不能抑制假病毒的感染活性;但HPV16和18 VLP免疫血清能明显的抑制HPV16和HPV18假病毒的感染活性。结论 成功构建并制备了2种高危型HPV假病毒,并可用于中和试验评价HPV疫苗血清抗体的中和活性。     

人呼吸道合胞病毒兰州株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

目的构建用于呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)体外拯救的RSV基因组全长cDNA克隆,并进行鉴定。方法根据RSV Long株基因组序列设计并合成引物,利用RT-PCR技术分6段扩增RSV LZ01/09基因组序列并构建克隆载体;测序后,利用重叠PCR与酶切连接技术,根据基因组序列选择特异性酶切位点,引入Kpn I、Xma I和Sal I酶切位点,构建成4个亚克隆载体;将亚克隆载体的插入片段连接至经过改造且包含T7启动子、锤头状核酶、多克隆位点、丁肝核酶、T7终止子的p RSV1载体中,构建RSV基因组全长cDNA克隆;对克隆全长cDNA序列进行测定,与亲本RSV LZ01/09基因组进行同源性比对分析,并与RSV实验参比株进行系统进化树分析。结果测序结果显示,RSV LZ 01/09的基因组全长为15 204 bp,与GenBank公布的RSV基因组序列长度相当,将完整的序列提交GenBank,登录号为KY782635;酶切及测序结果显示,用于RSV全长cDNA克隆构建的基本载体p BSKS-MCS(简称p RSV1)与预期相符,RSV全长基因组cDNA克隆质粒(简称转录载体p RSV1-4F)酶切片段大小与预期一致;同源性比对结果显示,全长cDNA序列与亲本RSV LZ01/09基因组序列同源性高达99.83%;系统进化树分析结果显示,其与RSV-A亚型序列同属于一个分支。结论测序及酶切分析结果表明已成功构建RSVLZ01/09基因组全长cDNA克隆,为建立拯救RSV重组病毒的反向遗传学系统平台奠定了基础。