广东虫草小分子热激蛋白基因HSP30的克隆及表达分析

小分子热激蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)是一类重要的具有调控有机体生长发育及响应环境变化功能的蛋白家族。本研究以广东虫草(Tolypocladium guangdongense)为对象,对其小分子热激蛋白基因HSP30进行克隆,对其氨基酸结构进行生物信息及系统发育分析,并采用实时荧光定量(RT-qPCR)方法检测HSP30在广东虫草不同发育时期及非生物胁迫下的相对表达量。结果表明：HSP30基因编码211个氨基酸,编码区序列长度为636 bp,无内含子,预测其蛋白分子量约为23 864.42 Da。系统发育分析显示,广东虫草HSP30蛋白与头状弯颈霉(Tolypocladium capitatum)的同源蛋白聚为一个分支,与奇异弯颈霉(T.paradoxum)和冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)的同源蛋白具有较高的相似性,序列一致性分别为86.38%和66.81%。RT-qPCR结果表明,与菌丝期相比,原基期和子实体发育过程中HSP30表达量显著下调;与对照相比较,非生物胁迫条件下HSP30表达量亦显著下调。上述研究结果...     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-HSP60的克隆、序列分析及温度胁迫下的表达

【目的】马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种世界性检疫害虫,对温度胁迫具有极强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子机制,研究了热激蛋白HSP60在马铃薯甲虫温度胁迫应答过程中的作用。【方法】采用RT-PCR及RACE技术克隆马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因的cDNA全长序列;利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术分析该基因在温度胁迫下的表达模式。【结果】克隆得到马铃薯甲虫热激蛋白HSP60基因,命名为Ld-HSP60(Gen Bank登录号:KC556801),其cDNA全长2 234 bp,开放阅读框(ORF)长1 731 bp,编码576个氨基酸,相对分子量约为61.27 kD,理论等电点为5.51,5'端非翻译区(UTR)长101 bp,3'UTR长402 bp。氨基酸序列中含有HSP60家族典型的特征序列。实时荧光定量PCR结果表明,低温胁迫(-10和0℃)下未检测到马铃薯甲虫雌雄成虫中Ld-HSP60的诱导表达;高温胁迫(38和44℃)诱导马铃薯甲虫雄成虫Ld-HSP60上调表达,随着胁迫温度的升高LdHSP60表达量呈现先升高后降低的趋势,38℃高温胁迫下表达量最高,胁迫时间越长Ld-HSP60表达量也越高。【结论】相比其他热激蛋白,HSP60对温度敏感性较低,推测HSP60可能在马铃薯甲虫雄成虫抵御高温胁迫中发挥作用。     

RNAi法分析广东虫草热激蛋白40 CgDnaJ05基因功能

DnaJ蛋白(热激蛋白40)在机体生长发育和适应逆境环境过程中起着重要作用。以广东虫草GDGM30035为材料,克隆获得CgDnaJ05基因,CDS为2 361 bp,编码786个氨基酸,生物信息学分析结果表明CgDnaJ05蛋白含有DnaJ蛋白结构域,属于碱性、不稳定和亲水性蛋白质。以CgDnaJ05蛋白DnaJ保守结构域240 bp的反向互补片段为干扰片段,构建CgDnaJ05基因的双向启动子沉默载体;通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化法侵染广东虫草菌丝,筛选获得9个相对稳定的CgDnaJ05沉默转化子。qRT-PCR分析表明,转化子CgDnaJ05相对表达量下调至野生型菌株的20%-82%;与野生菌丝相比,转化子菌丝生长速度显著下降,且CgDnaJ05下调越明显,菌丝减缓速度越显著,同时,转化子原基的形成受到显著抑制。研究表明：广东虫草CgDnaJ05基因明显影响广东虫草菌丝生长和原基形成,对广东虫草生长发育具有重要的调控作用。     

基于转录组分析高温抑制广东虫草原基形成的调控网络

在大型真菌原基形成和子实体发育的过程中,温度是一个极其关键的因素,高温显著影响多种食用菌原基的形成和子实体的品质。广东虫草是中国华南地区特有的虫草类新食品原料,其子实体富含多种活性成分和营养成分,且能够进行较大规模人工栽培。然而,温度对广东虫草原基形成的影响及调控机制尚不清楚。本研究通过不同温度处理不同时间段,发现29℃处理3d抑制了广东虫草原基的形成;对29℃处理3d处理前后的菌丝阶段（CK）和原基阶段（CK-P和HT-P）样品进行转录组测序分析,高温处理后原基阶段的两个组中发现1 682个差异表达基因,其中1 015个上调表达和667个下调表达。在碳水化合物代谢途径中,多个糖酵解和三羧酸循环及葡聚糖和海藻糖合成相关基因在高温处理后呈现下调表达;在原基样品中,多个热激蛋白基因（Hsp10、Hsp23、DnaJ、Hsp70、Hsp90和Hsp98）和转录因子C2H2转录水平显著上调表达。本研究结果基于分子水平揭示了高温影响原基形成过程中能量代谢和相关基因的差异表达,为后续利用广东虫草抗逆相关基因资源培育新品种奠定了重要的基础。     

金针菇几丁质合成酶基因家族鉴定及其表达分析

【背景】几丁质是真菌细胞壁的重要成分,由几丁质合成酶（chitin synthase,CS）催化合成。几丁质合成酶编码基因在大型食用真菌金针菇中的数量及表达规律尚不明确。【目的】探究几丁质合成酶基因在金针菇中存在的数量及其在子实体不同发育时期的表达规律,为其在大型真菌子实体生长发育过程中的功能研究提供基础。【方法】基于已有的金针菇菌株L11基因组数据,结合NCBI其他真菌CS序列鉴定金针菇中几丁质合成酶编码基因的数量,并对其进行生物信息学分析。进一步根据金针菇F19转录组数据以及实时荧光定量PCR （RT-qPCR）技术分析金针菇CS基因家族的表达规律。【结果】在金针菇单核体菌株L11的基因组中鉴定到9个几丁质合成酶基因,系统发育分析表明它们在子实体发育过程中的表达模式可分为4类（皮尔森相关系数=0.85）。【结论】金针菇CS基因家族表达模式在金针菇不同生长发育时期均存在差异,可能参与了子实体发育不同时期和组织的形态建成。     

瓜实蝇热激蛋白Hsp90基因克隆及表达分析

【目的】热激蛋白基因Hsps在生物体抗逆性过程中具有重要的作用,本文旨在通过阐释瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)热激蛋白基因Hsp90在其对环境温度适应性及抗药性过程中的功能作用,为瓜实蝇综合治理提供理论基础。【方法】采用RACE-PCR技术克隆瓜实蝇的Hsp90基因cDNA序列,利用生物信息学工具分析序列特征,并通过实时定量PCR技术分析高温胁迫、阿维菌素诱导和抗性及敏感品系中该基因的表达情况。【结果】克隆获得的瓜实蝇Hsp90基因cDNA全长2 654 bp,命名为Bc-Hsp90,GenBank登录号为KP864677,含2 145 bp的开放阅读框,编码715个氨基酸蛋白,具有HSP90蛋白家族共有模式和1个基序标签,C-末端具有MEEVD基序,属于胞质型热激蛋白。系统发育分析显示,Bc-Hsp90基因高度保守。不同高温(32-40℃)胁迫处理1 h和2 h后,瓜实蝇成虫体内Bc-Hsp90的相对表达量均显著高于对照组(26℃),并在38℃和40℃表达量最高;阿维菌素长期筛选的RS品系,Bc-Hsp90表达量是对照SS品系的2.13倍,但RS品系以LC90剂量诱导后,Bc-Hsp_(90)表达量显著下调,随着恢复时间延长其表达量逐渐升高,96 h后恢复到对照水平。【结论】推测Bc-Hsp90在瓜实蝇耐热性和抗阿维菌素过程中可能起着重要作用。     

蛹虫草线粒体DNA与细胞核DNA进化关系的比较

【目的】分析蛹虫草是否存在核内线粒体DNA片段,比较蛹虫草线粒体DNA与细胞核DNA的碱基变异程度及所反映的菌株间的系统发育关系。【方法】通过本地BLAST或LAST对蛹虫草线粒体基因组和核基因组进行序列相似性搜索;从10个已知线粒体基因组的蛹虫草菌株中分别扩增7个细胞核蛋白编码基因片段,并与其在14个线粒体蛋白编码基因上的碱基变异情况进行比较。【结果】蛹虫草核基因组中存在5处较短的核内线粒体DNA片段,总长只有278bp。蛹虫草核DNA的变异频率整体上高于线粒体DNA。核DNA和线粒体DNA所反映的蛹虫草菌株间的系统发育关系存在显著差异。【结论】蛹虫草线粒体DNA与核DNA间不存在长片段的基因交流,二者变异频率不同,所反映的蛹虫草菌株间的系统发育关系也有差异。本研究增加了对蛹虫草线粒体与细胞核DNA进化关系的认识。     

沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP的克隆及表达分析

【目的】克隆沙葱萤叶甲Galerucadaurica保幼激素结合蛋白基因(Juvenilehormonebinding protein,JHBP)cDNA全长序列,分析其分子特征和表达特性,为进一步明确其在沙葱萤叶甲生长发育及滞育中的作用奠定基础。【方法】基于本实验室组装的沙葱萤叶甲转录组数据库,采用RACE技术,克隆沙葱萤叶甲GdJHBP基因cDNA全长序列;运用ORF Finder、SignaIP、DNAMAN和TMHMM等软件分析其分子特征;利用MEGA6.0软件中的邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育树;应用荧光实时定量PCR(RT-qPCR)技术分析GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育时期、成虫不同组织及高温胁迫下的表达模式。【结果】克隆获得了沙葱萤叶甲保幼激素结合蛋白基因GdJHBP cDNA全长序列(GenBank登录号:MG460309),cDNA全长为826 bp,开放阅读框(ORF)为714 bp,编码237个氨基酸;蛋白质预测分子量为26.58ku,等电点为4.37;包含1条信号肽,无跨膜区,且在第27-189位氨基酸之间存在一个保幼激素结合蛋白家族JHBP保守结构域。序列比对分析表明,不同昆虫JHBP间氨基酸序列一致性较低,沙葱萤叶甲GdJHBP与棕榈象RhynchophorusferrugineusRfJHBP和马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata JHBP 3p2的氨基酸序列一致性最高也仅为30%。系统发育分析表明,GdJHBP与棕榈象血淋巴JHBP亲缘关系最近。RT-qPCR结果显示,GdJHBP在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,在幼虫期表达量最高,在卵和蛹期微量表达;在成虫滞育期间低表达,在滞育前与滞育结束后则有较高表达;在成虫发育过程中,头部的表达量显著低于腹部和胸部;高温(30-40℃)可诱导GdJHBP上调表达,在35℃时表达量达到最高值。【结论】沙葱萤叶甲GdJHBP属于血淋巴JHBP,在沙葱萤叶甲生长发育和成虫夏滞育中可能发挥着重要作用。     

粘虫过氧化氢酶基因的克隆与表达分析

【目的】过氧化氢酶(CAT)的主要功能是将过氧化氢分解成水和氧气,从而使生物免受氧化损伤的伤害。本研究旨在探索CAT在粘虫Mythimna separata抗氧化胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆粘虫CAT基因的cDNA全长序列和基因组序列,利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析该基因在不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、表皮、前肠、中肠、后肠和马氏管)以及毒死蜱、高温和密度胁迫下幼虫中的表达谱。【结果】克隆得到的粘虫CAT基因命名为MsCAT(GenBank登录号:MF737386),其全长cDNA长1 846 bp,开放阅读框为1 602 bp,编码533个氨基酸。序列分析发现MsCAT具有CAT家族典型的结构域,包括一个基部活化位点标签(~(88)FDRERIPERVVHAKGAGA~(105)),一个NADPH结合位点(~(216)VTHQVLYLFGD~(226))和一个亚铁血红蛋白结合位点(~(379)RLFSYSDTH~(386))。DNA序列分析表明,在MsCAT编码区99 bp处插入了一个612 bp的内含子。系统发育分析显示,MsCAT与夜蛾科(Noctuidae)昆虫的亲缘关系最近。MsCAT在粘虫的各个发育阶段和5龄幼虫各组织中均表达,分别在6龄幼虫和幼虫中肠中的表达量最高。取食经1μg/mL毒死蜱处理的玉米叶片24 h后,幼虫体内MsCAT表达量显著上调,但随浓度提高,表达量反而下降;在33~37℃温度处理后,幼虫MsCAT的表达量显著高于对照(24℃),而39℃处理幼虫MsCAT的表达量下调;此外,随饲养密度的增加幼虫体内MsCAT的表达显著下调。【结论】本研究克隆得到的粘虫CAT基因的cDNA全长序列(MsCAT)是可靠的,并且MsCAT在粘虫发育及抗氧化胁迫中具有重要的作用。     

沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因GdSP的克隆及对温度胁迫的响应

【目的】丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。本研究旨在克隆获得沙葱萤叶甲Galeruca daurica丝氨酸蛋白酶基因,分析其对温度胁迫的响应,以期为进一步揭示沙葱萤叶甲耐温性的调控机制及其他生理功能奠定基础。【方法】根据沙葱萤叶甲2龄幼虫转录组数据,采用RACE技术克隆得到沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析;应用qPCR技术检测其在不同温度(-10,-5,0,5,25和35℃)下处理1 h后及25℃下恢复30 min后在沙葱萤叶甲2龄幼虫中的表达量变化。【结果】自沙葱萤叶甲克隆获得一个丝氨酸蛋白酶基因,命名为GdSP(GenBank登录号:MG797556)。该基因全长1 110 bp,开放阅读框969 bp,编码322个氨基酸;蛋白预测分子量35.41 kD,等电点5.61;编码蛋白具有丝氨酸蛋白酶的典型特征,具有一个跨膜结构,无信号肽。同源序列比对和系统发育分析表明,GdSP与光肩星天牛Anoplophora glabripennis SP的同源性最高,氨基酸序列一致性为30.53%。qPCR测定结果表明,不同温度处理间2龄幼虫中GdSP表达量差异不显著,但对各高低温(-10℃除外)胁迫处理回温后GdSP表达量显著上升。【结论】快速冷驯化对沙葱萤叶甲丝氨酸蛋白酶基因表达无显著影响,而回温可诱导其上调表达。     

漆酶同工酶基因在斑玉蕈生长发育过程中的表达分析

为了探明漆酶在斑玉蕈生长发育过程中的功能,对斑玉蕈转录测序预测的13个漆酶基因序列进行分析、鉴定和构建分子系统发育树;检测了不同生长发育时期漆酶的活性和漆酶基因表达水平。研究结果显示：13个基因片段中有10个是漆酶基因。不同的漆酶同工酶之间进化关系存在明显差异,大多数漆酶与木腐菌（金针菇Flammulina filiformis和侧耳属Pleurotus）进化关系较近。对斑玉蕈不同生长发育时期的酶活检测结果显示,从斑玉蕈的菌丝恢复期到钉头期,漆酶活性逐渐升高,而在子实体形成后期酶活逐渐降低。对培养40d、60d和80d的菌丝样品以及不同生长发育时期的样品进RT-qPCR检测,结果显示在菌丝营养生长时期,大多数漆酶基因在第40-60天表达量持续增加1-3倍,而在第60-80天时表达量出现降低的情况。而在生殖生长时期,大多数漆酶基因在转色期或者原基期相对表达量达到最大值,并在子实体期出现降低,这与漆酶活性的检测具有一致性。lcc3、lcc7、lcc8和lcc9在斑玉蕈生殖生长过程中相对表达量出现了10-100倍的上调。这说明从菌丝培养到菌丝扭结形成子实体和子实体发育的过程中,不同的漆酶可能发挥着不同的作用,表达量较高的漆酶基因可能对基质降解和子实体形成起主要作用。     

糙皮侧耳生长发育过程中漆酶基因家族的表达研究

漆酶参与木质素的降解和食用菌的生长发育。为了明晰漆酶基因在糙皮侧耳生长发育过程中的作用,本文采用real-time PCR检测了11条漆酶基因及Lacc2的小亚基sspoxa3在糙皮侧耳生长发育不同阶段的表达。其中lacc6和sspoxa3在整个生长发育阶段表达量均较高;lacc12随着原基的分化和子实体的形成大量表达,与成菇过程有关。lacc4,lacc7和lacc11在原基分化期高表达,与原基的分化有关。lacc2,lacc3和lacc8在成熟子实体阶段表达量显著上升,与子实体的分化和成熟有关。     

信息素信号通路基因在斑玉蕈生长发育过程中的差异表达

为了更清楚地了解斑玉蕈菌丝成熟、原基形成和子实体发育的过程,本研究对不同菌丝培养时期的栽培瓶进行出菇实验,并对其不同培养时期和生长发育关键时期的信息素通路基因进行差异表达分析,以期揭示信息素信号通路基因参与调节斑玉蕈菌丝的生长、子实体形成和发育的作用。研究结果表明：斑玉蕈菌丝培养40-80d过程中,子实体产量呈上升的趋势,说明菌丝的成熟程度对产量会产生重要影响。对斑玉蕈基因组中的信息素信号通路基因进行分析鉴定共获得了8个关键基因。信息素通路基因差异表达分析表明：在菌丝培养40-80d过程中,大部分信息素信号通路基因在第60天时表达量最高,其中ste20、cdc24和ste12上调了4-20倍,而在第80天出现下降。从菌丝恢复到扭结形成原基和子实体发育的过程中,大多数基因在原基时期表达量最高,其中ste20、cdc24、ste11和ste12表达量上调最为显著,在子实体成熟期这些基因表达量下降。因此,这说明在菌丝营养生长过程中,在第60天菌丝细胞增殖生长最为旺盛,而在第80天菌丝细胞基本停止生长,菌丝也逐渐达到成熟。同时,在菌丝生殖生长过程中,斑玉蕈持续地上调信息素通路基因表达使菌丝细胞不断地分裂增殖,从而使新生的菌丝扭结形成原基,其中ste3、ste20、cdc24、ste11和ste12基因可能对斑玉蕈菌丝细胞的分裂增殖和诱导子实体形成起到关键的作用。     

Opposing developmental functions of Agrocybe aegerita galectin (AAL) during mycelia differentiation

Mycelia of basidiomycetes differentiating into fruiting body is a controlled developmental process, however the underlying molecular mechanism remains unknown. In previous work, a novel fungal Agrocybe aegerita galectin (AAL) was isolated from A. aegerita in our laboratory. AAL was shown to promote mycelial differentiation in A. aegerita and Auricularia polytricha, indicating that AAL might function as a conserved fruiting initiator during basidiomycete mycelia development. In the current work, we investigate the role of AAL in mycelia differentiation and fruiting body formation. First, the expression and localization of AAL in mycelia, primordium and fruiting body were assessed by Western blotting and immunohistochemistry. AAL was found to be ubiquitously expressed in the primordium and fruiting body but not in the mycelia. AAL facilitated mycelia congregation and promoted fruiting body production when AAL was applied on mycelia. At the same time, when AAL was spread on potato dextrose agar (PDA) medium prior to mycelia inoculation, mycelia exhibited slowed growth rates, resulting in mycelia cords formation and inhibition of fruiting body formation. The 5' regulatory sequence of aal was cloned by 'genome walking'. Here, we show that aal lack introns in the coding region and the upstream 740 bp sequence was characterized by the existence of core promoter elements, which included: two CCAAT boxes (-535/-280), a GC box (-145), a TATA box (-30) and a fungal leader intron within the 5' UTR. The identification of regulatory expression elements may provide an explanation to the stage-specific and high-level expression of aal during fruiting development.     

双孢蘑菇子实体发育不同阶段蛋白质组分析

为探讨双孢蘑菇子实体发育不同阶段的蛋白质表达变化,对双孢蘑菇As2796菌株子实体原基期、幼菇期、采收期、开伞期的蛋白质组进行了二维液相色谱串联质谱（iTRAQ-MS/MS）分析,共获得不同肽段5 869个,鉴定到1 059个蛋白质,其中1 007个具有相对定量信息。与双孢蘑菇原基期相比,幼菇期、采收期和开伞期分别有差异蛋白质242、200、240个,分别占鉴定蛋白质总数的24.0%,19.9%和23.8%。对这些蛋白质及不同阶段之间的差异蛋白质进行了系列生物信息学分析,对8个上、下调表达具有连续性的差异蛋白质相关基因进行了荧光定量PCR验证,其中3个蛋白质（错配碱基识别蛋白、细胞色素C1及某推定的未知蛋白质）基因的转录与蛋白质的表达具有较为一致的趋势。这些结果为后续双孢蘑菇子实体发育相关基因的功能研究奠定了良好的基础。     

MYB基因在玉米雌穗发育中差异表达的研究

目的:研究MYB基因在玉米雌穗不同发育阶段的表达情况,为探讨其生物学功能提供相关线索。方法:用芯片杂交的方法检测玉米雌穗早期发育过程中差异表达的MYB基因,定量PCR验证差异基因的表达情况,原位杂交分析差异基因的组织器官表达。结果:一个MYB基因在雌穗发育到小花分化期时上调表达(芯片分析其表达差异倍数为1.8)。其表达的差异性得到了定量PCR的验证(定量PCR分析其差异表达倍数为4.3)。原位杂交分析发现该基因主要表达于小穗的生长锥顶部和小花雌雄蕊原基部位。结论:MYB基因对玉米雌穗早期发育起到一定作用。     

刺芹侧耳不同发育时期的转录组差异分析

为了探讨刺芹侧耳子实体生长发育时期的基因表达变化,本文利用高通量测序技术对刺芹侧耳不同发育时期（菌丝期、原基期、子实体时期）进行RNA-Seq分析,在转录水平上解析差异表达基因在刺芹侧耳生长发育过程中的作用和功能。KEGG功能富集显示,菌丝期差异表达基因主要富集在碳代谢和氨基酸代谢中,其中三羧酸循环中编码柠檬酸合酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的基因表达量均上调,说明碳代谢和氨基酸代谢是菌丝时期的主要能量来源;原基期上调的差异表达基因主要富集在脂肪酸代谢,其中RT-PCR定量结果显示原基期编码脂肪酸合酶的基因和编码脂酰辅酶A合成酶的基因下调,编码超氧化物酶的基因和编码过氧化氢酶的基因上调,表明脂肪酸代谢和抗氧化酶对刺芹侧耳原基期维持机体的稳定和生物应激方面起着重要作用。子实体时期上调的差异表达基因主要富集在剪接体、类固醇的生物合成以及AMPK信号通路中,说明环境因子对子实体时期有一定的影响。     

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

[目的]本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的...