H5N1禽流感病毒实验室检测方法灵敏性比较

目的比对实验室常用的H5N1禽流感病毒检测方法灵敏性。方法增殖H5N1病毒,蚀斑技术定量待检病毒,应用细胞接种、血凝实验、RT-PCR、Real-time RT-PCR等方法检测稀释的病毒悬液,比较检测的最低滴度。结果细胞接种、Real-time RT-PCR、RT-PCR及血凝实验能检测病毒的最低滴度为10 PFU/mL、10 PFU/mL、103 PFU/mL及3.52×105 PFU/mL。结论几种检测方法比较而言,细胞接种与Real-time RT-PCR检测灵敏性最高;血凝实验用时最短,但灵敏性低,结果需要进一步确认;RT-PCR用时较较短,检测灵敏性较高。     

禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制

禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁。本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性。结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织;免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞;免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染II型肺泡细胞。结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能。     

A/H6N1亚型禽流感病毒致病性评估及与2009 A/H1N1亚型流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性

目的探讨人、禽流感病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性,为下一步研究H6亚型禽流感病毒重配和致病性变异的分子机制奠定基础。方法野鸭源A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/SanJiang/275/2007以101EID50～106EID50的攻毒剂量经鼻内途径感染小鼠,通过临床症状观察、病毒滴定和病理切片观察进行病毒学和组织学两方面检测对小鼠的致病性;同时,将此病毒与2009年A/H1N1流感病毒A/Changchun/01/2009(H1N1)混合感染豚鼠,分析两株病毒在哺乳动物体内的遗传兼容性。每天采集豚鼠鼻洗液并用噬斑纯化技术获得重配病毒,对获得的重配病毒进行全基因组序列的测定。结果 H6N1亚型禽流感病毒能直接感染小鼠,但对小鼠不致死。106EID50的攻毒剂量可有效感染小鼠,攻毒后第5天,小鼠表现出被毛较粗乱、活动减少、体重下降、呼吸急促的临床症状,但至攻毒后第10天开始康复,而对照组(MOCK)小鼠在14 d的观察期内无明显临床症状。病毒滴定结果表明,该病毒主要在小鼠肺脏和鼻甲骨中复制,病毒滴度可达104.5EID50/mL。病理学观察发现感染小鼠肺泡壁增厚,有大量炎性细胞浸润,纤维蛋白渗出并伴有轻微出血;在A/H6N1和A/H1N1混合感染豚鼠的重配实验中,经过三轮噬斑纯化从豚鼠鼻洗液中分离到6株重配病毒,说明A/H6N1亚型禽流感病毒与A/H1N1亚型流感病毒具有很好的遗传兼容性,能在豚鼠体内能发生重配。结论野鸭源A/H6N1亚型流感病毒无需适应就能够感染哺乳动物;该病毒与A/H1N1流感病毒具有很好的遗传兼容性,在哺乳动物体内能够发生基因重配,产生新的重配病毒,其公共卫生意义应引起高度关注。     

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞,得到了具有活性的甲型流感病毒.采用自行构建的含有polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间,得到了8个可在真核细胞中复制和表达的质粒.将这8个质粒共转染293T细胞,培养48h后吸取上清液,转接入MDCK细胞中,再经过72h培养,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生,测上清病毒血凝滴度为1:10.将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1).此结果将有助于国内今后对流感疫苗的研究.     

通过反向遗传操作技术构建传染性支气管炎病毒nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组毒株

传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)属于γ属冠状病毒,其核酸内切酶nsp15(Non-structural protein 15)的功能尚未得到解析.为探讨nsp15在IBV感染和复制过程中的作用,本研究对nsp15的核酸内切酶活性中心H238进行突变,通过体外连接技术构建重组病毒rIBV-nsp15-H238A,并对病毒滴度、感染复制能力和生长曲线进行鉴定.方法 如下:将IBV Beaudette-R毒株的基因组分成5个片段克隆到质粒载体,并在每个片段加上BsaI或BsmBI限制性酶切位点.通过质粒载体进行扩增后,通过酶切获得cDNA片段,在体外连接成全长基因组cDNA,转录出全长基因组RNA,跟N的转录本一起电击转染到Vero细胞,拯救出重组病毒rIBV和rIBV-nsp15-H238A.利用空斑试验检测比较rIBV和rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度和空斑大小,鉴定nsp15核酸内切酶活性对IBV感染性的影响.结果 显示,rIBV-nsp15-H238A的病毒滴度为2.7×106PFU/mL,比rIBV的病毒滴度(9.4×106PFU/mL)低3倍还多,且rIBV-nsp15-H238A空斑孔径远小于rIBV,说明rIBV-nsp15-H238A复制和扩散能力远低于rIBV.利用TCID50检测病毒的生长曲线,结果表明在感染后0～24h,rIBV-nsp15-H238A的生长曲线均低于rIBV.由此可见,IBV nsp15H238核酸内切酶活性位点对IBV的感染复制起着重要作用.本研究通过反向遗传操作构建nsp15核酸内切酶活性缺陷型重组病毒,为研究nsp15的功能提供了一个有力的工具.     

利用CRISPR/Cas9基因敲除技术研究Importin-α7对流感病毒生长特性的影响

流感病毒的跨种传播是一个包含病毒和宿主因子之间大量相互作用的复杂过程。除了转换细胞表面受体结合特异性,禽流感病毒还要克服核膜形成的另一个重要屏障–核输入机制来进入细胞核进行有效转录和复制。本文主要研究人源importin-α7对不同来源、不同亚型流感病毒生长的影响。根据CRISPR/Cas9靶点设计原则分别在人importin-α7功能域第5和第6个外显子设计一对小向导RNA(sgRNAs)并克隆入pX459载体,重组质粒共转染A549细胞,构建A549-importin-α7-KO细胞系;再分别用不同来源(人源、猪源和禽源)、不同亚型的甲型流感病毒与乙型流感病毒感染A549-importin-α7-KO细胞和野生型A549细胞,研究importin-α7对流感病毒生长特性的影响。经测序和Western blotting验证,成功构建A549-importin-α7-KO细胞系;激光共聚焦观察结果显示,importin-α7敲除后vRNPs入核减少;同时Importin-α7敲除后流感病毒的生长均受到抑制,其中importin-α7对人流感病毒A/California/04/2009(H1N1)和B/Brisbane/60/2008、禽流感病毒A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)、猪流感病毒A/Hunan/42443/2015(H1N1)和A/Jiangsu/1/2011(H1N1)的生长影响显著,而人流感病毒A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)和禽流感病毒A/Guangzhou/333/99(H9N2)在两种细胞中的生长差异不明显。不同流感病毒结合importin-α的特异性不同,提示流感病毒可能已经进化出不同机制来利用importin-α亚型进行核输入,这对于流感病毒的宿主适应性和致病力研究具有重要意义。     

季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对同型与异型流感病毒的免疫保护效力

为了研究季节性流感裂解疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的免疫保护效力及其与诱发的血凝抑制(HI)抗体滴度的关系,本研究使用我国2008~2009年度季节性流感裂解疫苗中不同剂量的甲1型流感病毒H1N1(疫苗株病毒A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like)和甲3型流感病毒的H3N2(疫苗株病毒A/Brisbane/10/2007(H3N2)-like)疫苗组分免疫BALB/c小鼠,首先确定了能在小鼠中诱发血HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量;然后以此剂量免疫小鼠,分别使用同型同株流感病毒(鼠肺适应株A/Brisbane/59/2007(H1N1)-like virus(MA))(简称A1)和同型异株流感病毒(鼠肺适应株A/Purto Rico/8/34(H1N1))(简称PR8)攻击H1N1疫苗免疫小鼠,使用异型异株流感病毒A1攻击H3N2疫苗免疫小鼠,通过体重变化和存活率情况,探讨季节性流感疫苗在小鼠中针对甲型流感病毒同型同株、同型异株、异型异株攻击的保护效力。结果显示,季节性流感裂解疫苗H1N1和H3N2组分按照HA不同剂量0.15μg、0.5μg、1.5μg、5μg和15μg免疫小鼠后,所诱发的HI抗体滴度随免疫剂量的增加而增强,1.5μgHA即可以诱发免疫小鼠HI抗体滴度达到40;以此剂量免疫小鼠,分别使用3LD50、10LD50、30LD50、100LD50、300LD50、1 000LD50和3 000LD50的同型同株流感病毒A1进行攻击,1.5μgH1N1疫苗可以100%保护小鼠抵御高至1000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,15μg甚至可以100%保护3 000LD50同型同株流感病毒A1的攻击,但是这两个剂量免疫的小鼠在低至3LD50同型异株流感病毒PR8的攻击后都全部死亡;使用可以诱发HI抗体滴度达到140的15μg H3N2疫苗免疫小鼠,在低至3LD50异型异株流感病毒A1的攻击后亦全部死亡。以上结果表明,季节性流感疫苗可使小鼠HI抗体滴度达到40的疫苗免疫剂量为1.5μg,该免疫剂量可以有效保护小鼠抵御同型同株流感病毒的攻击,但是难以保护小鼠抵御同型异株与异型异株流感病毒的攻击,这一结果为建立以季节性流感疫苗为参考的免疫保护评价体系提供了实验依据。     

PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒致病性的影响分析

目的利用A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,评估PB2 E627K对A/H6N1亚型禽流感病毒的致病性,探究A/H6N1流感病毒的致病性分子基础。方法通过A/H6N1亚型禽流感病毒A/Mallard/San-Jiang/275/2007株反向遗传操作系统和点突变技术拯救病毒rA/H6N1和PB2 E627K位点发生突变的rA/H6N1-627,两株拯救病毒分别以101EID50～106EID50的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、死亡率、病毒滴定等方面进行致病性分析。结果成功构建A/H6N1亚型禽流感病毒的反向遗传平台,rA/H6N1的8个基因片段完全源于A/H6N1的基因组,核苷酸序列及生物学特性与A/H6N1完全一致。rA/H6N1能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性(MLD50>106.5EID50),病毒在小鼠体内的分布情况及各个脏器中的病毒滴度与A/H6N1保持一致;rA/H6N1-627能感染小鼠,引起小鼠体重下降,但不能引起所有106EID50组小鼠死亡,病毒能在小鼠的肺脏和脑部进行增殖。结论实验结果表明,在H5N1禽流感中发挥重要作用的PB2-E627K位点并非A/H6N1流感病毒的毒力决定因子。A/H6N1流感病毒致病性的分子基础还有待继续研究,该反向遗传操作系统和点突变技术的建立为研究该亚型流感病毒致病机制、传播机制及病毒基因功能奠定了基础,同时也为A/H6N1亚型禽流感病毒新型疫苗的研制开辟了新途径。     

甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻2013年新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359和401的氨基酸变异位点熵值0.5。研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力引起突变的结果。     

甲型H9N2流感病毒神经氨酸酶单克隆抗体的制备及保护效果研究

目的制备甲型H9N2流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase, NA)单克隆抗体(简称单抗),研究其特性,并在小鼠体内评估NA单抗的保护效果。方法用H9N2 NA质粒经肌肉注射并辅以电脉冲免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术筛选出小鼠单抗M53,采用酶联凝集素测定法(enzyme-linked lectin assay, ELLA)和NA-XTD法测定其NA酶抑制活性,同时还进行了空斑抑制试验,以确定单抗M53对犬肾细胞中H9N2病毒复制的影响。此外,评估了单抗M53对H9N2流感病毒感染小鼠的预防和治疗性效果。结果在NA抑制试验中,单抗M53可抑制H9N2 NA对大分子胎球蛋白和小分子NA-XTD底物50%的裂解,IC_(50)分别约为4.48μg/mL和29.50μg/mL,表明单抗M53能够抑制H9N2病毒NA的活性。在空斑抑制试验中,当单抗M53浓度≥200μg/mL时,可显著抑制H9N2病毒在细胞间的低浓度传播。小鼠模型中,在H9N2病毒感染前24、48和72 h,使用30或10 mg/kg的单抗M53免疫1次,就可保护所有小鼠抵抗之后致死量的病毒攻毒,并显著降低小鼠肺部病毒载量。结论抗H9N2流感病毒的单抗M53具有作为流感病毒辅助治疗的潜力。