严重急性呼吸综合征冠状病毒2的预存免疫

新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2, SARS-CoV-2)感染引起,临床表现多样。近来,在未感染SARS-CoV-2的人群检测出了SARS-CoV-2特异性记忆CD4~+、CD8~+ T细胞和能识别SARS-CoV-2的抗体,这揭示了人群中存在SARS-CoV-2的预存免疫。这种预存免疫可由4种人冠状病毒(human coronavirus, HCoVs)感染诱导。这些HCoVs是季节性感冒的致病因子,其抗原表位和SARS-CoV-2有广泛的同源性。HCoV诱导的SARS-CoV-2的预存免疫可影响SARS-CoV-2感染的发生和COVID-19症状的轻重。该发现有助于SARS-CoV-2感染的血清学检测方法的改进和SARS-CoV-2疫苗的升级换代。     

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2感染/疫苗接种引起的免疫印记

先前发生的病毒感染或疫苗接种引起的免疫应答,强烈影响机体对该病毒后续暴露的免疫应答,这种现象被称为免疫印记。免疫印记也可出现在感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)或接种SARS-CoV-2疫苗的个体。发生了免疫印记的个体对再次遇到的完全相同的SARS-CoV-2毒株发动更强的免疫反应,而对新暴露的SARS-CoV-2变异株仅能发动微弱的免疫反应。免疫印记是SARS-CoV-2变异株在以前感染SARS-CoV-2或接种SARS-CoV-2疫苗的人群形成突破感染的一个不可忽略的原因。克服免疫印记是研制能预防未来SARS-CoV-2突变株感染的SARS-CoV-2疫苗的迫切任务。     

SARS-CoV-2重组S1和S蛋白疫苗诱导保护性免疫的研究*

目的:评价新型冠状病毒(SARS-CoV-2)重组S1蛋白和S蛋白疫苗对SARS-CoV-2的免疫保护效果。方法:将SARS-CoV-2重组S1蛋白和S蛋白分别联合氢氧化铝佐剂以0.1 μg/只、1 μg/只、5 μg/只、10 μg/只不同剂量接种6~8周BALB/c纯系健康雌性小鼠。第二次免疫后采血通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IgG抗体效价,通过假病毒中和试验比较免疫小鼠血清对SARS-CoV-2野生型株(WT)、英国株(B.1.1.7)、巴西株(P.1)、印度株(B.1.617.2)、Mu毒株(B.1.621)和南非株(501Y.V2-1)六种假病毒毒株中和活性效价,取脾细胞通过酶联免疫斑点技术(ELISpot)检测免疫小鼠的细胞免疫水平。结果:SARS-CoV-2重组S和S1蛋白都能诱导小鼠产生较强的IgG抗体水平。免疫S1蛋白的小鼠血清对SARS-CoV-2野生型株、英国株、巴西株有明显的中和活性,免疫S蛋白的小鼠血清除了对SARS-CoV-2野生型株、英国株、巴西株有明显中和活性之外,对印度株也有明显的中和活性,两种蛋白质免疫的小鼠血清均对野生型株中和效果最强。S蛋白免疫的小鼠脾细胞能够显著诱导出γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)的产生。S蛋白诱导产生的IgG抗体、中和抗体、细胞免疫水平均高于S1。结论:SARS-CoV-2重组S蛋白疫苗能够诱导产生较强的保护性免疫应答。     

GICA和CLIA联合检测SARS-CoV-2特异性抗体的检测策略研究

评价胶体金免疫层析法(GICA)与化学发光法(CLIA)联合检测对降低新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性抗体假阳性的效果。收集2020年1月22日至2020年3月5日就诊于川北医学院附属医院及南充市中心医院的19例SARS-CoV-2确诊患者不同时段的血清33份,55例非SARS-CoV-2、其他病原体感染及自身免疫性疾病患者的血清55份,采用GICA和CLIA分别对血清SARS-CoV-2 IgM、IgG进行检测,并对结果进行分析。GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的敏感性分别为100.0%、94.74%,与CLIA(92.86%和100.0%)比较没有差异(P>0.05);GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的特异性分别为70.91%、74.55%,明显低于CLIA的特异性(98.18%和89.09%)(P<0.01);两种方法检测SARS-CoV-2 IgM、IgG结果具有一致性(P<0.001),Kappa值分别为0.434,0.406;ROC曲线分析发现,GCIA检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的AUC分别为0.855、0.846,明显低于CLIA(0.955和0.945)(P<0.05)。两种方法联合检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的敏感性分别为92.86%、94.74%,特异性分别为100.0%、100.0%;ROC曲线分析显示,联合检测SARS-CoV-2 IgM、IgG的AUC分别为0.964、0.974,高于两种方法的单独检测。GICA和CLIA联合检测能有效提高SARS-CoV-2 IgM和IgG的检测特异性,值得临床推广应用。     

广东省首例新型冠状病毒的分离与鉴定

2020年1月,广东省陆续从湖北省武汉市输入多例疑似新冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的病例,经检测为SARS-CoV-2核酸阳性的实验室确诊病例。为进一步了解SARS-CoV-2毒力,满足药物研发和疫情防控等需求,并建立SARS-CoV-2分离方法为后续研究打下基础,本研究使用Vero-E6细胞,选择一例经Real-time RT-PCR鉴定为SARS-CoV-2阳性的肺泡灌洗液进行接种,逐日观察,肺泡灌洗液接种的细胞管4d出现疑似细胞病变(Cytopathic effect,CPE),再进行第二代接种2d出现病变,提取核酸进行鉴定,为SARS-CoV-2阳性。经二代测序成功获得全基因组序列,进化分析结果显示本次分离的毒株为SARS-CoV-2。     

SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2双价重组腺病毒载体疫苗可在小鼠诱导免疫保护

评价一种SARS-CoV-2 Beta变异株和甲型流感病毒H3N2新型重组双价疫苗在小鼠模型中的免疫保护效果。本研究构建了表达SARS-CoV-2南非变异株(B.1.351)棘突蛋白1(S1)和H3N2柬埔寨分离株(A/Cambodia/e0826360/2020)血凝素(HA)的重组双价非复制Ad5载体疫苗,命名为HAdV5-S1-2A-HA,经单针肌肉注射免疫BALB/c雌鼠后,采用ELISA、血凝抑制实验、假病毒中和实验与Elispot实验进行体液与细胞免疫学检测,免后3～6周采用H3N2-X31病毒、H1N1-PR8与SARS-CoV-2(B.1.351)进行攻毒保护实验。HAdV5-S1-2A-HA免疫两周后,低剂量组(1×10⁸vp/只)免疫小鼠后可检出HA特异体液免疫与S1特异的细胞免疫应答;而高剂量组(5×10⁹vp/只)诱导小鼠产生了较强的双抗原(S1,HA)特异的体液和细胞免疫应答,并能完全保护小鼠对H3N2-X31攻击,降低SARS-CoV-2(B.1.351)感染后小鼠肺部病毒载量,延迟H1N1-PR8病毒感染后小鼠死...     

尿素解离法降低新型冠状病毒IgM和IgG检测结果假阳性的效果评价

探讨引起新型冠状病毒(SARS-CoV-2)免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)抗体检测结果假阳性的干扰因素,改良检测方法,完善实验室检测方案。本研究收集2020年1月2日至2020年3月5日就诊于川北医学院附属医院及南充市中心医院的门诊及住院患者血清样本共74份,其中19例为SARS-CoV-2核酸检测确诊阳性,10例为其他呼吸道病毒IgM抗体阳性,10例肝炎病毒抗体IgM阳性,20例类风湿因子IgM阳性,15例抗核抗体阳性。采用胶体金免疫层析法(试剂A、试剂B)分别对研究对象血清进行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测,并对结果为SARS-CoV-2 IgM或SARS-CoV-2 IgG阳性的病例进行分析,发现造成检测结果假阳性的可能因素。再采用合适浓度的尿素对检测为阳性结果的血清及3例SARS-CoV-2 IgM阳性的COVID-19早期患者血清进行解离,解离后分别重新测定SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体。采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学分析。结果显示,19例COVID-19确诊患者血清中,试剂A检出SARS-CoV-2 IgM、IgG抗体阳...     

新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自暴发以来,严重威胁着人类健康。建立一种快速、可靠、易操作的可用于SARS-CoV-2感染早期诊断的检测方法,对于疫情防控至关重要。SARS-CoV-2核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein,NP）是抗原检测的理想靶点。为了建立一种可快速对SARS-CoV-2 NP进行定量检测的诊断方法,本研究通过免疫山羊制备羊抗SARS-CoV-2多克隆抗体并作为包被抗体,通过杂交瘤细胞技术制备鼠抗NP单克隆抗体并作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA抗原检测方法。对反应条件进行优化,并验证其线性范围及检测下限、敏感性、特异性、稳定性及准确度。结果显示,建立的方法检测线性范围为1 000 ng/mL～7.8 ng/mL,R2>0.99,检测下限为3.9 ng/mL;敏感性为96.875%,特异性良好,与Vero细胞、SARSCoV-2刺突蛋白、流感病毒等不发生交叉反应;批内和批间变异系数分别为2.1%～11.7%和4.3%～11.8%;检测样品回收率在94.3%～104.8%之间。结果表明,该方...     

对24例宠物临诊病例检测未发现新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸阳性

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种在人体中新发现的冠状病毒,来源于野生动物。SARS-CoV-2属于冠状病毒科β冠状病毒属,而感染宠物犬猫类的冠状病毒主要来自α冠状病毒属。SARS-CoV-2是否感染犬、猫等宠物是当前抗击新冠肺炎疫情的重要公共卫生问题,也是大众关切的热点问题之一。本研究试图通过对有明晰腹泻和呼吸道症状的宠物犬和猫进行病原学检测,来阐明SARS-CoV-2是否感染宠物的科学问题,探究腹泻和呼吸症状宠物感染的普遍病因。本研究采用SARS-CoV-2的荧光定量PCR试剂和已经建立的诊断方法,对SARSCoV-2流行期间北京地区有腹泻和呼吸道症状的(特别是有发烧、严重咳嗽症状)临床宠物猫病例(20例)和宠物犬病例(4例)采集咽拭子,并进行SARS-CoV-2核酸荧光定量PCR检测和犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(Canine adenoviru-2,CAV-2)、犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)、猫疱疹病毒I...     

SARS-CoV-2受体结合域蛋白的表达、纯化和鉴定

目的实现严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)受体结合域(receptor-binding domain, RBD)蛋白的高效分泌表达,获得纯度较高的目的蛋白,并对目的蛋白与不同抗体的结合活性进行比较分析。方法将SARS-CoV-2 S蛋白RBD和RBD-Mouse IgG2a Fc基因优化合成后分别克隆入pcDNA3.1(+)或者pLexm表达载体,然后将获得的重组质粒转染HEK293F细胞,比较不同表达载体及添加标签对目的蛋白表达量的影响,选取表达量高的重组质粒进行后续转染,收获细胞上清后进行蛋白纯化。纯化后的蛋白分别与灭活SARS-CoV-2免疫马血清、CR3022抗体进行反应,比较RBD蛋白与不同抗体的结合活性。结果成功构建含SARS-CoV-2 RBD序列的不同重组表达质粒,表达结果显示,与其他质粒相比,RBD-mg2afc/pcDNA3.1(+)在细胞上清中获得较高水平的表达。纯化后的RBD蛋白纯度大于95%,Western blot检测结果显示,加热变性后的目的蛋白可以与灭活SARS-CoV-2免疫马血清发生特异性反应,但是与CR3022抗体几乎不发生反应;ELISA检测结果表明,纯化后的RBD蛋白可以与2种抗体均发生特异性反应,当抗原包被量低于500 ng/孔时,RBD蛋白与灭活SARS-CoV-2免疫马血清的结合能力高于其与CR3022抗体的结合能力,当抗原包被量高于500 ng/孔时,RBD蛋白与CR3022抗体的结合能力更强。结论成功表达和纯化了RBD蛋白,该蛋白在不同包被抗原量条件下与抗体的结合活性不同。     

实时荧光定量PCR快速鉴别新型冠状病毒主要变异株北大核心CSCD

为建立一种快速鉴别严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的5种主要变异株的Taq Man探针实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)体系,基于SARS-CoV-2野生型及变异株alpha (N501Y、HV69-70del)、beta (E484K、K417N)、gamma (K417T、V1176F)、delta (L452R、T478K)和omicron (H655Y、N679K、P681H)序列设计特异性引物、探针,建立和优化一种鉴别新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 5种主要变异株的Taq Man探针RT-qPCR方法,并进行该方法的特异性、敏感性、鉴别能力评价。该方法可准确区分出SARS-CoV-2野生型和突变型,与其他呼吸道病原体(n=21)无交叉,显示高特异性。该方法最低检测限为2×10;拷贝/mL,操作简单、快速、成本廉价,可用于监测SARS-CoV-2毒株的变异,精准指导疫情识别与防控。     

新型冠状病毒一步法可视化恒温快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染导致急性或致命性肺炎,该病毒是继严重急性呼吸系统综合征病毒(SARS-CoV)和中东呼吸系统综合征病毒(MERS-CoV)之后发现的又一由动物传染给人且能够人传人的冠状病毒。为快速确诊感染SARS-CoV-2的人和动物,急需建立一种快速高效的检测方法。本研究根据GenBank公布的SARSCoV-2全基因组序列,利用LAMP Desiner2.0软件筛选高效且特异性强的组合环引物和Bst 4.0 DNA聚合酶的扩增特性,即依赖RNA为模板进行DNA合成,建立一种高效、快速、灵敏检测SARS-CoV-2的方法。结果表明,该方法实现了5～20拷贝的病毒RNA检测目标,并可直接检测灭活病毒。因此,临床样本无需RNA提取,经灭活处理后即可进行样品检测。扩增后的核酸分子与OG(Orange-Green)染料结合,阳性样品为绿色,阴性样品为橙黄色。本研究建立的SARS-CoV-2一步法可视化恒温快速检测方法,实现了核酸快速检测,且具有高灵敏度,为SARS-CoV-2检测提供了新的方法选择。     

免疫层析法检测2019新型冠状病毒抗体假阳性的原因分析和对策

2019年12月,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)首次被发现并很快引起全球大流行,SARS-CoV-2感染的早期诊断对疫情防控至关重要.胶体金免疫层析法检测SARS-CoV-2抗体是诊断新型冠状病毒肺炎的重要标准之一.该方法具有操作简便,报告快速,不需要仪器设备等优点.然而,该方法也存在假阳性较多的问题,给临床诊断带来了很大的困惑.本文分析和总结了在临床中采用胶体金免疫层析法检测SARS-CoV-2抗体产生假阳性的原因.结果表明最为常见的内源性干扰包括类风湿因子、嗜异性抗体、人抗动物抗体、溶菌酶、补体和交叉抗原.外源性干扰主要为标本凝固不全,标本污染和试剂盒反应体系优化不足.内源性干扰可以通过稀释、封闭和酶切等方法降低非特异性结合来减轻;消除外源性干扰需操作者严格按照实验室操作规程规范操作.此外,将兔抗μ链和/或γ链抗体F(ab')2作为固相载体的包被抗体,采用含非特异性兔IgG的Buffer,也能有效降低内源性干扰物造成的假阳性.     

新型冠状病毒基因组序列的网络平台与基因分型

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是引起2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体,目前COVID-19仍在世界范围内大规模流行。随着学者对SARS-CoV-2研究的不断深入,以及各大数据库的序列资源共享,一些学者开发了SARS-CoV-2相关序列分析网络在线平台,并发表了对SARS-CoV-2基因分型、命名的规则。"GISAID"是目前SARS-CoV-2基因组序列共享和储存最大的数据库,"Nextstrain"和"CoV-GLUE"是国际最常用的SARS-CoV-2序列分析平台。目前有四种比较通用的SARS-CoV-2的基因分型方法,在本文中分别简称为:"中国分型法"、"Pangolin分型法"、"GISAID分型法"和"Nextstrain分型法"。这四种分型方法的定义不尽相同,但又有相似之处。本综述对目前SARS-CoV-2在线分析网络平台和不同的基因分型方法进行了较为系统的介绍、对比和总结。     

间充质干细胞在新型冠状病毒肺炎治疗中的研究现状

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致,可发生严重肺部损伤甚至死亡,目前为止仍在全球范围内广泛蔓延。SARS-CoV-2感染依赖于血管紧张素转换酶2(ACE2)和Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,可导致机体免疫紊乱,促发炎症风暴从而损伤靶器官。COVID-19目前尚无特效药物,间充质干细胞(MSCs)具有组织修复和免疫调节等功能,而且在流感病毒相关性肺炎及其他肺疾病中有一定疗效,因此可能是治疗COVID-19潜在有效药物。目前部分研究也显示出积极的治疗效果,而具体的疗效仍需进一步的临床研究来验证。     

全球新型冠状病毒变异株研究进展

截至2021年5月11日,基于Pango命名法,依据新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的基因组变异变迁将其划分为1281种亚型或分支.而SARS-CoV-2刺突(spike,S)蛋白的变异直接影响病毒的生物学功能.2020年下半年至今,全球多个国家和地区监测发现SARS-CoV-2的S蛋白发生氨基酸突变,特别是受体结合区或单克隆抗体结合位点氨基酸突变引起病毒的传播力和致病力改变以及部分免疫逃逸等.世界卫生组织将重要变异株划分为"关切变异株(variant of concern,VOC)"和"关注变异株(variant of interest,VOI)".其中,VOC 有4个,分别是 VOC 202012/01、501Y.V2﹑P.1 和 B.1.617;VOI 有6个,分别是 CAL.20C、P.2、B.1.526、B.1.525、B.1.616和P.3.一些氨基酸突变在多个VOC和VOI病毒株中交叉出现或同时出现,E484K/Q等重要氨基酸突变引起的部分免疫逃逸导致全球现有疫苗免疫效力下降,但现有新冠疫苗对VOC和VOI变异株仍然有效.本文通过对SARS-CoV-2变异株流行概况及S蛋白重要氨基酸突变特征进行归纳分析,为新冠病毒变异株的监测、防控和二代疫苗的研制策略提供科学参考.     

CpG联合铝佐剂增强RBD-Fc重组蛋白诱导小鼠免疫反应效果的研究

由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病（Coronavirus disease 2019,COVID-19）大流行对全球健康和经济构成了严重威胁,SARS-CoV-2关切变异株（Variants of concern,VOCs）的出现更增加了疫苗研发的难度,因此,优化设计对突变株具有广谱免疫反应的疫苗显得尤为重要。本研究选取具有大量显性中和表位的受体结合域（Receptor-binding domain,RBD）蛋白作为目标抗原,在SARS-CoV-2经典株RBD序列的基础上引入多个VOCs的关键突变位点,将其与人IgG1 Fc片段融合表达,并结合CpG单佐剂、氢氧化铝单佐剂或CpG与氢氧化铝复合佐剂两剂次免疫小鼠,比较CpG联合铝佐剂相比单独使用铝或CpG佐剂诱导细胞免疫和体液免疫反应的增强作用,同时观察小鼠产生抗不同VOCs活病毒的交叉中和抗体滴度。结果显示,与单佐剂相比,RBD-Fc蛋白结合CpG与氢氧化铝复合佐剂免疫小鼠可产生最高的IgG结...     

新型冠状病毒假病毒制备方法的优化及应用

该文旨在建立一种稳定高效的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒构建方法,并将所制备的假病毒用于评估抗体中和水平。通过比较不同穿梭质粒、质粒配比以及转染试剂对假病毒滴度的影响,优化制备高滴度假病毒的条件;通过制备不同的SARS-CoV-2突变株假病毒,测试该方法的稳定性;利用所制备的假病毒对SARS-CoV-2抗体的中和能力进行评价,测试该方法的可靠性。优化结果表明,当使用Lipofectamine^TM3000作为转染试剂时,pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP?psPAX2?pcDNA3.1-S以0.300μg?0.225μg?0.240μg的质量比转染获得的假病毒滴度最高。进一步,发现利用该方法包装的三种突变株的假病毒均可达到较高滴度。利用该方法制备的假病毒可以用于SARS-Co V-2抗体的中和活性检测,测得IC₅₀值为0.126μg/m L。该研究成功建立了一种简单高效的制备新型冠状病毒(SARS-CoV-2)假病毒的方法,其可用于体外评估SARS-CoV-2抗体中和活性,为研发SARS-CoV-2相关疫苗和药物的体外评...     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2的突变株及其疫苗

伴随着严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗(也称COVID-19疫苗)在世界各地预防接种的展开,SARS-CoV-2突变株也在世界多地相继出现,其中有的突变株可能对现行SARS-CoV-2疫苗诱导的抗体产...     

靶向SARS-CoV2-受体结合结构域的嵌合抗体表达及功能研究

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染所致的2019冠状病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)给人民的生命健康造成了严重的威胁,目前该病毒仍然在广泛传播,针对SARS-CoV-2有效的治疗方法仍有限,因此寻找广谱中和抗体阻断SARS-CoV-2感染具有重要的意义。本文成功表达并纯化了3株靶向SARS-CoV-2的受体结合结构域(receptor-binding domain, RBD)的人鼠嵌合抗体,并且检测了这几株抗体对多种SARS-CoV-2假病毒和活病毒的中和活性。本研究表明这3株抗体能特异性地中和SARS-CoV-2野生型假病毒,IC₅₀分别为0.03μg/mL、0.06μg/mL、0.03μg/mL。此外,这3株抗体对Alpha株假病毒、Delta株假病毒和Lambda株假病毒也具有广谱中和活性,并可以抑制SARS-CoV-2 Delta株活病毒的复制。机制研究表明,这些抗体可以阻断SARS-CoV-2的...