细胞膜转运分子ABCC3和SLC7A7在肠道病毒A71型感染中作用的初步研究

肠道病毒A71型(enterovirus A71,EV-A71)是导致手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的主要病原体之一,目前对其治疗尚无特异高效的抗病毒药物.研究表明,细胞膜转运相关分子参与病毒的入侵、复制以及感染性子代病毒颗粒的释放.为寻找宿主中可有效抑制EV-A71感染的细胞膜转...     

肠道病毒A71型VP1-E98K突变对hSCARB2-KI小鼠致病性的影响

目的 探究肠道病毒A71型(enterovirus A71, EV-A71)VP1-E98K突变对人清道夫受体B2敲入(human scavenger receptor class B member 2 knock-in, hSCARB2-KI)小鼠致病性的影响。方法 利用pSVA-EV-A71-Isehara感染性克隆重组质粒获取拯救的EV-A71 Isehara株,分别在人恶性胚胎横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma, RD)细胞和转染hSCARB2的RD细胞(RD-hSCARB2)中传代并收获病毒,感染小鼠后建立hSCARB2-KI小鼠感染模型。研究中还采用了感染小鼠的临床评分指标、RT-qPCR、HE染色和免疫荧光技术、ELISA、病毒滴定等方法研究病毒的致病性。结果 用RD细胞中连续传代获得的EV-A71 Isehara株攻击hSCARB2-KI小鼠,未观察到预期的体质量减少、行动迟缓、肢体瘫痪等临床表现;经测序确定该病毒株衣壳蛋白发生了VP1-E98K突变,故称之为VP1-98K突变株。而野毒型EV-A71 Isehara株(VP1-98E野毒株)感染的h...     

肠道病毒71型(EV71)荧光病毒的构建

人肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)是引起手足口病的主要病原体。首先利用反向遗传学的方法,构建了EV71全长cDNA感染性克隆,经体外转录、转染RD细胞后成功获得了拯救病毒。随后,将增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入到EV71基因组中构建荧光病毒。结果表明,此荧光病毒不仅可以侵染、复制,在传代的过程中EGFP基因也保持了较好的稳定性,表明其可以作为一种报告病毒应用于高通量的EV71抗病毒药物筛选中。     

肠道病毒A71型3C蛋白结构、功能及抗3C蛋白药物的研究进展

肠道病毒A71型(Enterovirus A71,EV-A71)可引起手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD),严重者伴有神经系统并发症,如无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿等。EV-A71引起的HFMD自2007年以来在全世界,尤其是亚太地区多次暴发,已成为亚太地区公共健康的主要威胁之一。目前尚无有效的抗病毒药物或疫苗。EVA71的致病机制尚未完全研究清楚,而非结构蛋白3C在病毒的复制和抑制天然免疫方面发挥了不可替代的作用。EV-A71 3C蛋白的研究在进一步了解EV-A71的致病机制以及研制抗病毒药物方面发挥着重要的作用。本文将对EV-A71 3C蛋白的结构、功能以及抗3C蛋白病毒药物的研究进展做出综述。     

miR373和miR542-5p调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制

研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。为了揭示miRNAs是否参与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)的感染与复制,研究了miRNAs对EV71病毒在宿主细胞内复制的影响。构建miRNAs靶基因筛选系统,在双荧光素酶报告体系的pMIR载体插入病毒基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。实验发现EV71病毒5′-UTR基因可能是miRNAs的作用靶标。随后利用miRNAs在线分析软件预测并验证可能作用于5′-UTR基因片段的miRNAs。为了研究miRNAs分子对5′-UTR基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中,在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miRNAs mimics,利用Western blotting和real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。实验结果表明,miR373和miR542-5p可以通过作用于EV71病毒5′-UTR基因从而抑制病毒在RD细胞中的复制和表达。细胞内miR373和miR542-5p可以调控EV71在宿主细胞中的复制过程。研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。     

EV-A71感染小鼠巨噬细胞诱导促炎细胞因子和趋化因子反应

为初步探索EV-A71在小鼠巨噬细胞中的复制情况和抗病毒的固有免疫应答,本文以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为细胞模型,通过建立EV-A71绝对定量qPCR方法检测EV-A71病毒载量;EV-A71和紫外灭活的EV-A71感染RAW264.7,不同时间点提取总RNA,RT-qPCR检测促炎细胞因子、趋化因子和模式识别受体的mRNA表达变化水平。本研究成功建立了EV-A71的绝对定量qPCR检测方法,并发现EV-A71感染RAW264.7后随着感染时间的延长,EV-A71病毒载量呈递减趋势;EV-A71和紫外灭活的EV-A71可以引起IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子和IP-10、MCP-1、MIP-1α趋化因子反应,上调TLR2、TLR1、TLR6、MDA5和RIG-I mRNA表达。研究结果显示,EV-A71在小鼠巨噬细胞中具有较低水平的复制,同时产生促炎细胞因子和趋化因子反应。     

肠道病毒A71型亚单位蛋白对RD细胞自噬活化的影响

肠道病毒A71型（Enterovirus-A71, EV-A71）能够活化宿主细胞的自噬并依赖自噬促进其复制,然而EV-A71的亚单位蛋白对自噬的活化目前仍不清楚。为探讨EV-A71亚单位蛋白对人横纹肌肉瘤（Human rhabdomyosarcoma, RD）细胞自噬活化的影响,将EV-A71的亚单位蛋白重组真核质粒转染至RD细胞,采用抑制剂MK-2206阻断PI3K/Akt途径,共聚焦显微镜和免疫印迹检测自噬活化。过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞中PI3K/Akt途径、p38、JNK和ERK途径均呈现不同程度活化,同时RD细胞呈现出绿色荧光表明自噬发生活化,特别是EV-A71的VP2和2A。EV-A71亚单位蛋白使LC3-II/LC3-I的转化水平提升,EV-A71亚单位蛋白（VP2、VP3、VP4、2A、2B和2C）显著提升p62的表达水平,EV-A71 VP1显著下调p62的表达水平但显著上调LAMP-1和LAMP-2的表达水平。阻断PI3K/Akt途径后,过表达EV-A71亚单位蛋白的RD细胞绿色荧光强度显著减弱、自噬被阻断,同时LC3-II/LC3-I的转化水平显著降...     

人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

人博卡病毒1 (human bocaparvovirus 1, HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一。其感染2−5岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命。HBoV1基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse, ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成。本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1的全长感染性克隆pSKHBoV1。经转染HEK293细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染HEK293细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础。     

姜黄素通过p38 MAPK/NLRP3抑制肠道病毒71型诱导的细胞焦亡

肠道病毒-A71型(EV-A71)重症感染患儿多表现为过激的炎症反应，病毒感染引起的细胞焦亡可能是机体炎症发生的重要原因之一。本文旨在探究姜黄素对EV-A71病毒感染引起的细胞焦亡与细胞损伤的保护作用及可能的机制。首先，观察了姜黄素对EV-A71引起的细胞毒性的影响。CCK8检测结果显示，EV-A71感染降低细胞的增殖活力；LDH测定表明，病毒增加细胞培养上清中LDH的释放，造成了细胞的损伤；DAPI核染色及Dil细胞膜染色后观察到，EV-A71感染引起了细胞的形态变化和数量减少。姜黄素可以逆转病毒引起的上述变化，提示姜黄素对病毒感染的细胞毒性具有保护作用。细胞焦亡发生时，可促进炎症因子IL-1β的成熟、产生和释放。我们观察了EV-A71及姜黄素干预对细胞IL-1β产生的影响。Western印迹结果显示，病毒感染细胞内IL-1β的活化增加。ELISA检测结果显示，EV-A71病毒感染引起细胞上清中IL-1β的分泌水平增加；qPCR测定结果显示，EV-A71病毒感染细胞中IL-1β的转录水平上调；而姜黄素干预可抑制染毒细胞IL-1β的活化和分泌。Western印迹检测细胞内焦亡相关分子的...     

稳定表达T7 RNA聚合酶IBRS-2细胞系的建立以及利用该细胞系对SVDV的体内拯救

利用PCR从λ溶原性细菌DE3中扩增出T7 RNA聚合酶基因,定向克隆进逆转录病毒载体pBABEpuro,得到阳性重组质粒pTTBABEpuro.把该重组质粒与pVSV-G共感染GP2-293包装细胞系,形成假型病毒.通过polybrene介导假型病毒感染IBRS-2细胞,利用嘌呤霉素进行传代筛选,形成细胞系IBRST7.对不同代次的IBRST7细胞基因组进行PCR和RT-PCR鉴定,结果表明,T7 RNA聚合酶基因在细胞传代过程中能稳定存在,并能表达目的蛋白的mRNA.为了鉴定T7 RNA聚合酶在IBRST7细胞内是否具有转录活性,扩增口蹄疫病毒(FMDV)的内部核糖体进入位点(IRES)片段和EGFP基因,定向克隆于原核表达载体pET-43.Ia-c( )中,构建了T7启动子控制下转录的具有非帽依赖性表达的重组质粒pIERS-EGFP-ET,把该质粒转染IBRST7细胞,能够在紫外显微镜下观察到绿色荧光,说明EGFP得到了表达,表明IBRST7细胞系内的T7 RNA聚合酶具有转录活性.然后,利用该细胞系成功拯救出具有感染性的猪水泡病病毒(SVDV),并对其生物学功能进行了鉴定.该细胞系的建立为利用T7 RNA聚合酶转录系统体内高效拯救病毒提供了基础.该拯救病毒的策略使RNA拯救简化为一步快速的拯救方法,为进一步探索SVDV病毒致病的分子机制及研制新型SVD疫苗奠定了良好的基础.