真核生物蛋白质O-甘露糖基化的研究进展

蛋白质O-甘露糖基化是真核生物中广泛存在的蛋白质翻译后修饰过程,即在甘露糖转移酶(PMT)作用下将长萜酰甘露糖上活化的甘露糖连接到肽链上Ser或者Thr羟基的过程。本文着重介绍在真核生物里真菌和哺乳动物中O-甘露糖基化蛋白的O-甘露聚糖结构、合成过程和生物学意义。     

结核分枝杆菌中O-甘露糖基化蛋白功能的研究进展

蛋白质的O-甘露糖基化修饰不仅在真菌和哺乳类细胞中广泛存在,在原核生物中例如分枝杆菌属、棒状杆菌属和链霉菌属中也存在,尤其在引起人类疾病的结核分枝杆菌中研究最多。许多O-甘露糖基化蛋白在结核分枝杆菌毒力以及与宿主相互作用过程中发挥了重要作用。本文就结核分枝杆菌中O-甘露糖基化蛋白生物学功能的进展加以综述。     

结核病疫苗和耻垢分枝杆菌引起树突状细胞差异免疫反应的蛋白质组学分析

研究结核分枝杆菌和免疫细胞的相互作用对发展新的结核病防治策略至关重要.由于结核分枝杆菌生长缓慢,且需要在高等级生物安全实验室中进行操作,快速生长非致病的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)经常用来作为结核分枝杆菌的模式菌开展相关研究.为了探讨耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌对免疫系统产生的不同影响,本课题组利用缓慢生长的结核菌的减毒活疫苗卡介苗(BCG)和耻垢分枝杆菌mc2155分别感染小鼠(Mus musculus)树突状细胞DC2.4细胞,通过蛋白质组学分析,阐述宿主细胞对BCG和耻垢分枝杆菌不同的免疫反应.结果表明,BCG在DC2.4中生存时间比耻垢分枝杆菌长.定量蛋白质组学发现耻垢分枝杆菌激活了Ⅰ型干扰素信号通路,上调了AIM2,IFI204,IFIT1和ISG15蛋白的表达.相反,BCG的侵染对宿主细胞的蛋白组影响不大.分泌组学的结果显示,耻垢分枝杆菌的侵染诱导树突状细胞分泌更多的细胞趋化因子以及ISG15,TNF和IL-6等细胞因子,说明耻垢分枝杆菌的侵染促进了宿主细胞的细胞因子和趋化因子的释放,从而迅速地清除侵染的细菌.与此一致的是,耻垢分枝杆菌侵染的小鼠原代免疫细胞比BCG侵染产生更多的IFN-γ.进一步的研究发现,ISG15过表达阻止分枝杆菌进入宿主细胞.综上所述,本研究证明与缓慢生长的BCG相比,耻垢分枝杆菌引起宿主细胞更强烈的免疫反应,致使耻垢分枝杆菌在宿主细胞中被迅速清除.同时,本研究组发现耻垢分枝杆菌侵染引起的ISG15上调阻止了分枝杆菌进入宿主细胞.     

结核分枝杆菌Rv2629基因产物的亚细胞定位和穿梭质粒转化耻垢分枝杆菌

目的 研究结核分枝杆菌利福平耐药相关蛋白Rv2629在细胞内的亚定位及其与药敏的相关性。 方法 采用差速离心进行细胞组分分离及Western-blot检测初步判定蛋白亚细胞定位;采用pMV261转化耻垢分枝杆菌,BACT MGIT960测定转化菌株的利福平耐受性。结果 Rv2629蛋白主要定位于结核分枝杆菌的细胞壁和细胞膜,重组有Rv2629 突变位点191C质粒的耻垢分枝杆菌对利福平的MIC为160mg/L,相应的携带有野生型基因191A的宿主菌MIC为20mg/L。结论 Rv2629基因191A/C突变同利福平耐药相关。     

结核分枝杆菌蛋白Rv3425对细菌表型及毒力影响的研究

为探索蛋白Rv3425在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M. tuberculosis)中的功能,本研究以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis)为模式菌株,构建重组了耻垢分枝杆菌Ms-Rv3425。分别将构建菌株(Ms-Rv3425)、野生株(Ms)及空载对照(Ms-Pact)接种于7H9-OADC培养基中37 ℃培养,观察Ms-Rv3425与Ms及Ms-Pact之间在生长速率、菌落形态、生物膜以及聚集度方面的差异。分别用低pH值以及含有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄西林、异烟肼及利福平的培养基进行培养,计算存活率以分析抗逆和抗药能力;用上述压力条件培养结核分枝杆菌标准株H37Ra,分析Rv3425内源表达量的变化;进行THP-1细胞感染和BALB/c小鼠攻毒实验分析菌株的毒性变化。结果显示,与Ms及Ms-Pact相比,Ms-Rv3425的菌落形态更为粗糙且隆起,成膜及聚集能力增强;在压力条件下,Ms-Rv3425表现出更高的抗逆和抗药能力,H37Ra中Rv3425的表达量也显著上调;胞内存活率及小鼠致死率更高,各脏器病理损伤更为严重。综上所述,过表达Rv3425能够改变耻垢分枝杆菌的表型,提高抗逆性、抗药性和毒力。深入探讨PPE家族蛋白Rv3425的功能,将为结核病的防治带来新的视角。     

耻垢分枝杆菌MSMEG_6281 过表达对菌株生长和形态的影响

【目的】耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis mc2155,mc2155)MSMEG_6281为结核分枝杆菌自溶素Rv3717的同源蛋白,通过建立过表达MSMEG_6281的耻垢分枝杆菌菌株,推测该蛋白对耻垢分枝杆菌肽聚糖代谢的影响。【方法】利用RT-PCR方法检测乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)作用后MSMEG_6281基因的表达变化;以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板,采用PCR技术克隆MSMEG_6281基因,构建分枝杆菌表达质粒p VV16-MSMEG_6281,进一步建立MSMEG_6281过表达的耻垢分枝杆菌菌株;利用生长曲线检测MSMEG_6281过表达对耻垢分枝杆菌生长的影响;利用扫描电子显微镜分析MSMEG_6281过表达引起的耻垢分枝杆菌形态变化。【结果】EMB处理引起MSMEG_6281基因表达上调;构建了过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌菌株(mc2155/p VV16-MSMEG_6281);过表达MSMGE_6281的耻垢分枝杆菌生长缓慢,菌体形态由短杆状转变为长杆状。【结论】MSMGE_6281的过表达可改变耻垢分枝杆菌形态。MSMGE_6281的功能与细胞壁肽聚糖水解相关,在mc2155细胞壁形态维持方面发挥重要作用。     

髓样分化因子88抑制剂ST2825影响重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞炎性分泌功能

目的通过观察髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,myd88）抑制剂ST2825对重组耻垢分枝杆菌感染的THP-1细胞的炎性分泌功能的抑制,来探讨髓样分化因子88在分枝杆菌促巨噬细胞分泌炎性因子功能中的作用。方法使用Myd88的抑制剂ST2825干预重组耻垢杆菌感染的THP-1细胞为实验模型,分为三组：实验组（THP-1细胞＋重组耻垢分枝杆菌＋ST2825）、对照组（THP-1细胞＋重组耻垢分枝杆菌）、空白组（THP-1细胞）,用ELISA法检测三组TNF-α、IL-12和IL-6的分泌情况。结果实验组的TNF-α、IL-12和IL-6的量较对照组显著减少,其两者P值〈0.05,差异具有统计学意义。结论髓样分化因子88抑制剂ST2825可抑制THP-1细胞的炎性分泌功能。     

结核分枝杆菌脂蛋白Rv1016c增强细菌成膜能力和抑制自噬

目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)脂蛋白Rv1016c在Mtb感染和结核病发病中的作用和机制。方法将Mtb脂蛋白Rv1016c基因导入野生耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, MS)构建重组菌株MS-Rv1016c,比较脂蛋白Rv1016c对菌体生长、成膜能力、细菌聚集、毒力等方面的影响,评估重组菌株MS-Rv1016c对自噬的影响。结果 Rv1016c基因的导入,因过表达脂蛋白使得MS的菌落变大、褶皱增加,使菌体聚集度降低,使细菌成膜速度加快、生物被膜产量增加;Rv1016c显著抑制巨噬细胞自噬,促进细菌在细胞内持留。结论 Rv1016c能够促进MS生物被膜形成,抑制细胞自噬,增强细菌毒力。为研究脂蛋白在Mtb致病机理中的作用提供理论依据。     

巨噬细胞冠蛋白-1 siRNA对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞冠蛋白-1(Coronin-1)与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)逃逸免疫杀伤有关。该研究探讨了p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒靶向抑制巨噬细胞Coronin-1表达后对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。用该质粒转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,采用RT-PCR法和Western blot检测质粒转染前后细胞Coronin-1的表达水平。以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)分别感染转染质粒组细胞和对照组细胞,通过细胞内细菌菌落计数和细胞爬片抗酸染色法评估巨噬细胞转染质粒前后对细菌的吞噬能力;利用流式细胞术检测转染质粒组细胞及对照组细胞吞噬耻垢分枝杆菌后不同时段的细胞凋亡水平。结果显示,该质粒能显著抑制RAW264.7细胞Coronin-1的m RNA水平及蛋白表达水平;感染耻垢分枝杆菌6 h后,转染质粒组细胞内细菌数显著高于对照组细胞(P0.05);感染耻垢分枝杆菌48 h后,转染质粒组细胞凋亡水平显著高于对照组细胞(P0.05)。以上结果表明,p S-EGFP-SP-Coronin-1si RNA重组质粒能显著抑制巨噬细胞Coronin-1的表达,并可显著促进巨噬细胞吞噬细菌和凋亡杀菌,为开发靶向巨噬细胞Coronin-1的抗结核基因治疗措施奠定基础。     

分枝杆菌脂聚糖的分离、纯化及其结构和功能分析

【目的】建立分离、纯化分枝杆菌脂聚糖的方法,初步比较分析不同菌株来源的脂阿拉伯甘露聚糖(Lipoarabinomannan,LAM)和脂甘露聚糖(Lipomannan,LM)的结构差异及研究脂聚糖刺激对巨噬细胞环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达的影响。【方法】应用Triton X-114液相法提取脂聚糖,电洗脱法分离纯化,基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)进行分子量鉴定;基于特异性识别非还原性末端α-D-甘露糖基的刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)分析新诺分枝杆菌JDM601、结核分枝杆菌H37Rv标准株和耻垢分枝杆菌mc2155脂聚糖的结构差异;进一步用Western blot检测脂聚糖刺激的RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结果】通过电洗脱法成功纯化出3种菌株脂聚糖;MALDI-TOF/TOF-MS鉴定发现,分子量从小到大依次为新诺分枝杆菌JDM601、耻垢分枝杆菌mc2155和结核分枝杆菌H37Rv来源的脂聚糖。Western blot显示,Con A能与结核分枝杆菌H37Rv标准株来源的LAM相互作用,而不能与新诺分枝杆菌JDM601和耻垢分枝杆菌来源的LAM相互作用;并且发现Con A与新诺分枝杆菌JDM601来源的LM有很强的反应,然而与其余两种来源的LM反应很弱。3种菌株来源的脂聚糖均能刺激RAW 264.7巨噬细胞COX-2蛋白的表达。【结论】首次成功对来源于中国临床分枝杆菌分离株的脂聚糖进行了分离纯化,初步探讨了不同菌株来源分枝杆菌脂聚糖的结构差异,并表明LAM和LM均能刺激巨噬细胞诱导COX-2蛋白的表达,为进一步研究其对宿主的毒力和免疫机制奠定了基础。