超声破裂载基因微泡增强心肌细胞报告基因的转染与表达

目的:通过超声破裂载基因微泡介导报告基因心肌细胞转染,探讨其能否增强心肌细胞外源基因转染与表达.方法:以β-galactosidase质粒为报告基因,将其与自制氟碳气体微泡粘附,制备载基因微泡.利用诊断性超声破裂微泡进行体外心肌细胞基因转染;以磷酸钙共沉淀转染为阳性对照并将其以不同方式与超声破裂微泡技术联合应用,以期进一步增强基因转染效果.分别采用原位染色及酶学定量检测β-galactosidase表达水平,同时进行细胞活性检测.结果:超声破裂载基因氟碳气体微泡(PESDA)转染组心肌细胞β-galactosidase表达水平可达单纯质粒转染组60倍(P＜0.01).磷酸钙共沉淀转染3.67倍(P＜0.01)超声强度、微泡浓度对超声破裂介导基因转染效果有明显影响.超声破裂微泡技术与磷酸钙共沉淀联合应用可进一步提高报告基因的表达(P＜0.05),即使在磷酸钙转染后6 h,超声破裂微泡仍能明显增强报告的基因的表达(P＜0 05).结论:超声破裂微泡技术是一种高效基因转染方法,其不但能增加DNA转染,而且增强入胞后基因的表达.超声破裂微泡与其它基因转染技术联合应用能进一步增加基因转染效率.     

siRNA沉默SIRT1基因对宫颈癌细胞HeLa增殖和凋亡的影响

化学合成靶向SIRT1基因的小干扰RNA,脂质体法转染人宫颈癌细胞株HeLa,观察小干扰RNA沉默SIRT1基因对HeLa增殖及细胞凋亡的影响。在优化siRNA SIRT1转染条件的基础上,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白及凋亡相关蛋白的表达;CCK-8法检测细胞增殖抑制率;Hoechst荧光染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果表明,siRNA SIRT1转染细胞组SIRT1 mRNA水平和蛋白表达量明显低于对照组;siRNA SIRT1转染组细胞增殖受抑制,细胞凋亡率明显增加;凋亡相关蛋白P53、P21表达上调,Survivin表达下调。上述结果表明:siRNA SIRT1诱导的HeLa细胞凋亡与P53、P21、Survivin通路关系密切,但siRNA SIRT1诱导HeLa细胞凋亡的详尽机制有待进一步研究。     

稳定干扰核糖体蛋白RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株的建立

目的建立稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株。方法设计并合成靶向人RPS7基因的shRNA寡核苷酸片段,克隆到逆转录病毒载体pSIREN中,构建重组质粒pSIREN-RPS7-shRNA,转染293T细胞,将包装产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌HeLa细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞克隆,用real-timePCR和Western印迹检测细胞中RPS7mRNA和蛋白表达水平。结果获得了经测序鉴定正确的重组逆转录病毒质粒,逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出的稳定细胞中,RPS7mRNA和蛋白水平均显著低于干扰对照细胞。结论成功构建了靶向人RPS7基因的shRNA逆转录病毒载体,建立了稳定抑制RPS7基因表达的宫颈癌HeLa细胞株．为进一步研究RPS7在宫颈癌中的生物学功能和作用机制提供了可靠的细胞模型。     

趋化因子CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性表型的影响及机制

目的 研究趋化因子CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性表型的影响及其机制.方法 通过基因转染构建过表达趋化因子CXCL5的宫颈癌HeLa细胞株,研究过表达CXCL5对宫颈癌HeLa细胞恶性行为和肿瘤相关基因表达的影响.结果 CCK-8、集落形成和划痕实验结果显示,过表达CXCL5可明显促进HeLa细胞的增殖和迁移能力;W...     

人IL-12重组逆转录病毒载体在HeLa细胞中的表达

目的:包装携带人白细胞介素12(IL-12)的逆转录病毒,用于宫颈癌的治疗研究.方法:携带IL-12的逆转录病毒重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装,G418筛选.在NIH3T3细胞进行病毒滴度测定.然后用病毒感染人宫颈癌细胞HeLa.PCR、RT-PCR方法检测IL-12基因在HeLa中的整合和表达情况.结果:重组质粒pL35P40SN经PA317细胞包装后收获病毒上清,感染HeLa细胞,检测发现IL-12基因整合到细胞基因组DNA中,并且能有效的转录.结论:成功包装了携带IL-12基因的逆转录病毒,该病毒能有效感染HeLa细胞,并使携带的基因IL-12在细胞中表达,为今后IL-12基因治疗宫颈癌的研究奠定基础.     

p53基因对人胃癌细胞系恶性生长的影响

以p53cDNA为探针,用Southern印迹法对人胃癌细胞系BGC823进行了检测,发现该细胞中P53基因存在异常．将可在真核细胞表达的重组野生型P53质粒PC53一SN3和突变型P53质粒PC53—SCX3,用脂质体介导法,分别导入BGC823细胞,获得了较长时间耐受G418的多个阳性克隆．Southern印迹法证实阳性克隆细胞中有外源性P53基因存在．比较BGC823细胞,转染野生型及突变型P53质粒的3种细胞生长曲线和软琼脂集落形成状况发现,野生型P53基因对BGC823细胞恶性生长有一定抑制作用．     

RNA干扰HIF-1α影响宫颈癌HeLa细胞上皮细胞间质变标记蛋白的研究

目的 通过RNA干扰技术沉默人宫颈癌HeLa细胞缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）的表达,在细胞水平研究HIF-1α对宫颈癌HeLa细胞上皮细胞-间质变标记蛋白（E-cadherin,N-cadherin,vimentin）表达的影响.方法 将人宫颈癌HeLa细胞株（H0细胞）、转染pGenesil-1空白质粒的HeLa细胞株（H1细胞）及转染HIF-1α-shRNA质粒的HeLa细胞株（H2细胞）分别行常氧及缺氧（150 μmol/L CoCl2培养12 h）培养,应用Western印迹、免疫细胞化学法检测每组HeLa细胞中HIF-1α、上皮标记蛋白E-cadherin、间质标记蛋白vimentin、N-cadherin的表达情况.结果 Western印迹分析各缺氧组HIF-1α、E-cadherin、vimentin及N-cadherin的平均光密度值,免疫细胞化学显示H0细胞、H1细胞缺氧时HIF-1α、N-cadherin、vimentin蛋白高表达,而E-cadherin低表达,H2细胞在乏氧时HIF-1α、N-cadherin、vimentin蛋白表达显著减弱,而E-cadherin高表达.结论 通过shRNA干扰抑制人宫颈癌HeLa细胞HIF-1α,可一定程度上抑制乏氧环境中宫颈癌HeLa细胞上皮细胞-间质变.     

siRNA沉默HPV18-E7基因表达对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响

研究小干扰RNA(siRNA)沉默18型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus 18,HPV18)E7基因对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和增殖的影响。培养人宫颈癌HeLa细胞株,构建靶向E7基因的两条siRNA,转染HeLa细胞株(实验组:分为siE7-1组和siE7-2组),以不做任何处理的HeLa细胞作为空白对照组(NC),转染无功能siRNA的HeLa细胞作为阴性对照组(Scramble,SCR)。转染48h后,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测转染E7siRNA后HeLa细胞mRNA含量变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测E7蛋白表达量变化;流式细胞术Flow cytometry(FCM)检测HeLa细胞凋亡情况;克隆形成和CCK-8检测HeLa细胞生长增殖情况。与NC组相比,siE7-1组和siE7-2组E7基因mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P0.01);转染48h后,与NC组相比,siE7-1和siE7-2实验组HeLa细胞内HPV18-E7蛋白表达水平明显下降(P0.05);转染48h后,siE7-1组和siE7-2组的细胞凋亡率分别为17.78%和36.44%,与NC组相比明显增多,差异有统计学意义(P0.01),细胞凋亡结果提示siRNA沉默E7促进HeLa细胞凋亡;CCK-8实验结果显示siE7-1组和siE7-2组细胞生长增殖抑制,差异有统计学意义(P0.01);克隆形成实验结果与CCK-8实验结果一致,siE7-1组和siE7-2组HeLa细胞形成的克隆数明显少于NC组,细胞生长增殖抑制(P0.01)。研究结果表明,沉默E7基因促进人宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制增殖,为宫颈癌治疗提供潜在靶点。     

超声造影剂协同下的高强度聚焦超声对包虫原头蚴酶活性的影响

为探索高强度聚焦超声结合适宜比例的微泡造影剂对离体细粒棘球绦虫原头蚴酶活性的影响,实验分离包虫原头蚴,在原头蚴悬液中加入比例为1:80的微泡造影剂(含氟脂质体微泡),以声功率为50W的高强度聚焦超声波辐照30s,辐照后悬液涂片作酶组织化学染色,检测原头蚴三磷酸腺苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶和琥珀酸脱氢酶的活性。结果显示,超声剂量相同时,微泡造影剂组的原头蚴三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶活性明显低于单纯超声辐照组(P<0.05);葡萄糖-6-磷酸酶活性有一定降低;阴性对照组无酶反应物产生。高强度聚焦超声结合微泡造影剂能增强对离体原头蚴三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。