人鼻咽癌上皮细胞(CNE)高温株三种表型的变化

本文报道CNE细胞高温(41℃)株及其两个克隆株(CNE/2e-H,CNE/2a-H)在软琼脂中的集落形成率、对培液血清的敏感性,以及对ConA的凝集反应,并与相应的常温株(CNE,CNE/2e和CNE/2a)进行了比较。结果发现,高温株在软琼脂中的集落形成率和ConA凝集率均明显低于其常温株,分别为P<0.05和P<0.05—0.01。当血清浓度由20%降低为5%时,培养7天后各常温株的细胞密度变化不明显(P>0.05),但各高温株则差别显著(P<0.05—0.01)。鉴于体外转化的细胞和体外培养的肿瘤细胞能在半固体培基中的生长特性与其成瘤性之间存在密切的相关性,再结合另外两种表型的改变,可以认为CNE-H、CNE/2e-H和CNE/2a-H经长期41℃培养后可能出现了细胞恶性程度减弱的变化。     

特发性血小板减少性紫癜与巨细胞病毒、EB 病毒感染相关性

目的:探讨小儿特发性血小板减少性紫癜(ITP)与巨细胞病毒、EB病毒感染的关系。方法:实验组:48例确诊断为ITP患儿,对照组:44例同期呼吸道感染患儿,应用酶联免疫吸附法(ELISA)对两组小儿外周血进行巨细胞病毒IgM抗体(HCMV-IgM)、EB病毒感染IgM抗体(EB-IgM)检测。结果:48例ITP患儿中HCMV-IgM抗体阳性者20例,阳性率为41.67%,明显高于对照组,两组之间差异有显著性(P<0.01);EBV-IgM抗体阳性者14例,阳性率为29.17%,明显高于正常对照组,两组之间差异有显著性(P<0.05)。结论:1、巨细胞病毒感染是引起特发性血小板减少性紫癜的重要原因之一,且通过临床观察巨细胞病毒感染引起的ITP患儿病情重,病程长,治疗时间长,转为慢性ITP的可能性大;2、EB病毒感染可能是引起特发性血小板减少性紫癜的原因之一,并且EB病毒感染引起的特发性血小板减少性紫癜病情也偏重。     

特发性血小板减少性紫癜与巨细胞病毒、EB病毒感染相关性

目的：探讨小儿特发性血小板减少性紫癜（ITP）与巨细胞病毒、EB病毒感染的关系。方法：实验组：48例确诊断为ITP患儿,对照组：44例同期呼吸道感染患儿,应用酶联免疫吸附法（ELISA）对两组小儿外周血进行巨细胞病毒IgM抗体（HCMV-IgM）、EB病毒感染IgM抗体（EB-IgM）检测。结果：48例ITP患儿中HCMV-IgM抗体阳性者20例,阳性率为41.67%,明显高于对照组,两组之间差异有显著性（P〈0.01）;EBV-IgM抗体阳性者14例,阳性率为29.17%,明显高于正常对照组,两组之间差异有显著性（P〈0.05）。结论：1、巨细胞病毒感染是引起特发性血小板减少性紫癜的重要原因之一,且通过临床观察巨细胞病毒感染引起的ITP患儿病情重,病程长,治疗时间长,转为慢性ITP的可能性大;2、EB病毒感染可能是引起特发性血小板减少性紫癜的原因之一,并且EB病毒感染引起的特发性血小板减少性紫癜病情也偏重。     

Epstein-Barr病毒特异性T细胞对重组痘苗病毒表达LMP和EBNA2的靶细胞的识别

本文用EB病毒转化自体淋巴细胞所建立的类淋巴母细胞系(LCL),以及用EB病毒潜伏感染膜蛋白(LMP)基因和核蛋白-2(EBNA2)基因与痘苗病毒重组的重组病毒(Vac-LMP和Vac-EBNA2)感染的自身纤维母细胞,同时作为刺激细胞和靶细胞,以~(51)Cr释放法检测5例血清中EB病毒VCA—IgA抗体阳性者及1例阴性健康者外周血单个核细胞(PBMC)的特异性T细胞杀伤效应。结果表明,用自身LCL激活的EB病毒特异性T细胞杀伤效应高峰出现在第14～28天;参与杀伤性细胞免疫反应的T细胞亚群主要是T3、T8阳性的细胞毒性T细胞,其对靶细胞的识别及杀伤受HLA-I的限制。用重组牛痘病毒感染的纤维母细胞作靶细胞或刺激细胞,有1例供者可接受LMP,另1例可接受EBNA2的刺激,并对相应的靶细胞产生特异性T细胞杀伤反应,表明EB病毒-LMP和EBNA2可能既是EB病毒特异性T细胞的刺激抗原,又是其识别的靶抗原。     

三单位保存的艾氏腹水癌细胞株及克隆细胞蛋白质表达

目的　比较三个单位保存的艾氏腹水癌 (EAC)细胞株及克隆细胞的蛋白质表达。方法　对北京市肿瘤研究所 (北京 )保存的EAC进行克隆培养 ,从中选出 5株克隆 ;对武汉大学保种中心 (武汉 )、山东省医学科学院药物研究所 (山东 )及北京保存的EAC细胞株及 5株克隆细胞的SDS PAGE电泳图谱及免疫组化蛋白质分布进行了对比。结果　武汉、山东及北京保存的EAC的电泳条带数分别为 2 2、2 5及 2 8条 ,而克隆细胞E2G8为 2 6条带。三单位EAC瘤细胞对 5种抗体做免疫组化染色 ,与 1株抗体反应的阳性细胞比例均较高 ,差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,与另 4种抗体反应的阳性细胞率差异有显著性 ;5株克隆细胞对 10种抗体作免疫组化染色 ,其中克隆细胞E2G8、E2F4与 7种抗体反应阳性 ,E2C6与 8种抗体反应阳性 ,E1G5、E2B5与 6种抗体反应阳性。克隆细胞一旦与某种抗体反应阳性 ,阳性细胞的比例即在 85 %以上。结论　不同单位保存的EAC细胞株及克隆细胞株蛋白质表达有差异     

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 ,该蛋白具有良好的抗原性和免疫原性     

Epstein-Barr病毒相关的淋巴细胞确定的膜抗原和潜伏感染膜蛋白的某些生物学特性及其与鼻咽癌关系的研究进展

已有大量研究工作证实,Epstein-Barr(EB)病毒与鼻咽癌的关系十分密切。因而,EB病毒在鼻咽癌病因学中的作用引起了人们的广泛重视。在EB病毒与宿主细胞相互关系的研究中,抗原表达与细胞隐性感染和细胞转化的相互关系,是目前所确认的关键课题之一。近年来的研究已经表明,EB病毒感染宿主细胞后,有多种EB病毒的特异性抗原产生,包括早期抗原(EA)、壳抗原(VCA)、膜抗原(MA)、核抗原(EBNA)、淋巴细胞确定的膜抗原(Lymphocyte-defined membrane antigen,LYDMA)和EB病毒潜     

EBNA3C与Gemin3两种蛋白形成复合物及相互作用的结构域

探讨EB病毒核抗原3C(EBNA3C)与Gemin3的相互结合及其作用区域。用Flag-EBAN3C与GFPGemin3共转染HEK 293细胞,采用免疫共沉淀、谷胱苷肽-S转移酶共沉淀及免疫荧光蛋白共存实验确定EBNA3C与Gemin3两种蛋白在体内、体外相互结合及相互作用的结构域。EBNA3C与Gemin3两种蛋白在体内外相结合,二者通过各自的C端相互结合。EBNA3C与Gemin3两种蛋白形成稳定复合物。     

EB病毒诱导胸腺恶性T细胞淋巴瘤的研究

为研究EB病毒在恶性T细胞淋巴瘤发生中的作用,将EB病毒感染的人胚胸腺细胞移植于Scid鼠皮下,于移植后第3日起在移植处对侧皮下注射TPA50ng／只,每周1次。于移植后第4周起,移植处皮下有结节状隆起形成,并逐渐增大。于6－15周内行病理学检查和免疫组织化学染色,证实为T细胞淋巴瘤8例。其中实验组胸腺细胞＋EBV的成瘤率为25％（1／4）,胸腺细胞＋EBV＋TPA组的成瘤率为53.8%（7／13）,对照组胸腺细胞＋TPA的成瘤率为0（0／5）。PCR和 闰杂交在诱导肿瘤可可检测到EB病毒的基因EBERs、LMP1和BARF1,并有病毒基因LMP1蛋白编码产物的表达。EB病毒可感染人胚胸腺细胞,并使其发生恶性转化,EB病毒可能在恶性T细胞淋巴瘤的发生中起病因作用。     

cAMP对癌细胞增殖周期的影响和膜表面ConA受体分布相关性

用流式光度计、放射自显影和荧光标记等方法研究了体内艾氏腹水癌(EAC)细胞经cA-MP诱导后,在其增殖过程中细胞周期和细胞膜表面ConA受体复合物分布之间的相关性。结果表明:接种后5—9天实验组S期细胞增加45.3％,同时ConA受体复合物分布呈帽状的比率和LI(~3H-TdR掺入)均大于对照组。但G_2+M期细胞的比率及MI却小于对照组,后者呈断续簇状分布的细胞比率大于实验组。至接种后11天,实验组细胞继续簇状分布的比率急剧增加,达6.18倍。这时S期细胞比率和LI均下降,而G_2+M期细胞反而大于对照组。     

8209例住院儿童EB病毒感染情况分析

目的了解住院儿童EB病毒感染情况。方法采用ELISA法检测患儿血清中EBV-VCA-IgM和IgG抗体,分别从年龄、性别、季节、涉及的疾病等相关因素进行统计分析。结果 8 209例儿科住院病人EB病毒总体感染率为68.84%,近期感染率为14.76%,10~15岁组总体感染率最高为93.50%,各年龄组感染率差异有统计学意义(P0.05),感染率随年龄增长而逐渐增高;男童EB病毒感染率67.52%(3 308/4 899),女童为70.79%(2 343/3 310),女童感染率高于男童(P0.05);EB病毒感染存在季节差异,1-3月份感染率最高,7-9月份相对较低;EB病毒感染累及全身多系统而引起相应的疾病,1 212例近期感染患儿中传染性单核细胞增多症186例(15.35%)、支气管肺炎142例(11.72%)、急性扁桃体炎112例(9.24%)。结论 EB病毒感染在本地区住院儿童中占有一定比例,小儿EB病毒感染症状多样,可累及全身多系统,需提高对本病的认识,综合分析,早期诊断,早期治疗,同时加强护理,提高治疗效果。     

人体正常扁桃体和淋巴结T、B淋巴细胞亚群的研究

本文用了一系列T、B淋巴细胞单抗,用免疫细胞化学技术观察了人淋巴结和扁桃体内T,B淋巴细胞及其亚群。T细胞及其亚群主要位于滤泡间的副皮质。此外在淋巴结髓质也有一定数量的T细胞亚群的分布;次级滤泡生发中心也常出现辅助T或Leu 4阳性T细胞。B淋巴细胞及其亚群多集中在初级和次级滤泡,如OKB_2和BA 1阳性细胞多集中于次级滤泡的帽状区,而IgM主要位于次级滤泡的生发中心。LN-2抗体选择性地与生发中心??和帽状区的B细胞的核膜起反应,是研究B细胞表型的一种重要试剂。     

EB病毒对脐带血细胞产生免疫球蛋白的影响

探讨EB病毒是否使培养的脐带血B细胞、CD5+B细胞产生免疫球蛋白及具有天然自身抗体性质的免疫球蛋白。无菌采集新生儿脐带血,RosetteSepTM法分离全B细胞,免疫磁珠分离CD5+B细胞,将分离得到的全B,CD5+B,CD5-B三组细胞分别用EB病毒、紫外线照射灭活的EB病毒(UVEBV)、TPA刺激,于培养的第10～30d,每间隔4d分别留取上清,ELISA法检测培养上清中的IgG,IgM及抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)IgG,IgM,阳性对照为健康成人血清,阴性对照为未加刺激的培养细胞上清。EB病毒感染的3组细胞于培养的第7d发生转化,14d以后的培养上清中IgM,AKautoAbIgMOD值较对照组显著升高(p<0.01);UVEBV刺激细胞存活15d,其第14d的CD5+B细胞培养上清中IgMOD值高于对照组(p<0.05);TPA及未刺激的细胞存活7d,培养上清中未检测到免疫球蛋白。可见,EB病毒能使培养的脐带血B细胞、CD5+B细胞产生可能具有天然自身抗体性质的免疫球蛋白。     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

敲低Sec23a基因对人乳腺癌寡灶型转移细胞株体外细胞生物学特性的影响

针对来源于乳腺癌细胞MDA-MB-435的小鼠肺癌寡灶型转移肿瘤细胞株MDA-435-OL,利用慢病毒感染的方法建立稳定敲低Sec23a基因表达的细胞株MDA-435-OL-Sec23a-GFP和其阴性对照细胞株MDA-435-OL-LV3NC-GFP,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)增殖实验、Transwell小室细胞迁移实验、侵袭实验和琼脂克隆斑形成实验探索敲低Sec23a基因后,寡灶型转移肿瘤细胞株体外细胞生物学特性的改变。在寡灶转移细胞株中敲低Sec23a基因后,细胞生长曲线与倍增时间并没有显著差异(28.23 h和28.32 h,P0.05),但Transwell小室迁移细胞数量(58.50±2.81和39.60±3.21)、侵袭细胞数量(54.40±3.33和34.60±1.44)和细胞体外克隆形成率(0.67±0.05和0.37±0.03),均较阴性对照组显著增加(P0.001)。该研究结果表明,乳腺癌寡灶型细胞株稳定敲低Sec23a基因后,细胞的增殖特性并没有明显变化,但细胞的迁移、侵袭能力和克隆形成能力均增强。     

含EB病毒核抗原1重组腺病毒的构建及其在小鼠中免疫效果研究

构建含EB病毒核抗原1(ebna1)重组腺病毒疫苗防治鼻咽癌,并为鼻咽癌疫苗的研究提供药效学资料。PCR法扩增B95-8细胞株中ebna1的C-端部分片段,EcoRI和BglⅡ酶切后插入pDC316穿梭质粒,ebna1片段测序比对正确后,与腺病毒骨架质粒pBHG共转染293细胞。收集病变后细胞,通过流式细胞仪和Western blot检测EBNA1在293细胞中的表达。电镜下观察所获得的病毒颗粒大小,TCID50法确定重组腺病毒滴度。以2×108 VP/只的rAd-ebna1免疫BALB/c小鼠。在免疫结束后的第1、2、4和8周检测小鼠体内EBNA1特异性细胞免疫应答的水平变化。结果显示,经PCR扩增获得约900bp ebna1目的片段,测序结果与标准株序列一致,质粒共转染293细胞后,细胞出现病变,获得含EB病毒核抗原1重组腺病毒(rAd-ebna1),流式细胞仪和Western blot检测结果证实,ebna1在细胞中正确转录表达,收获病毒二代滴度可达108 TCID50/mL。rAd-ebna1免疫小鼠后,能够激活EBNA1的CD4+T细胞特异性细胞免疫应答。本实验成功构建了含ebna1片段的重组腺病毒,并具激活CD4+T细胞免疫应答活性。     

人肝癌细胞株H9101的建立及其细胞生物学特性研究

从厦门市肝癌高发的同安地区肝癌病人肝癌组织建立了人原发性肝细胞癌细胞系H9101.它生长迅速,群体倍增时间平均为38小时,对小牛血清的依赖性较低(1%).体外培养的H9101细胞贴壁生长,扫描和透射电镜下见细胞有丰富细长微绒毛.H9101细胞具有较高的软琼脂克隆形成率(1/200细胞)和裸鼠异种移植成瘤能力(100%).瘤细胞在ConA处理后呈较强的凝集性,在ConA 50ug/ml和100μg/ml时细胞凝集率分别为61%和92%.瘤细胞分泌微量的AFP,用1%DMSO和1.5×10-5mol/L地塞米松处理10天后上升到(140ng/ml/1×105细胞/24小时),且HBsAg转呈阳性.H9101细胞γ-谷氨酰转肽酶活性达5.42U±0.11U/mg,酪氨酸α酮戊二酸转肽酶活性达14.24U±1.50U/mg,与正常人肝细胞者相比差异显著(分别为P＜0.001和P＜0.01).H9101细胞染色体数为非整倍体,众数分布在52条-82条,具人类细胞染色体特征,其DNA经PCR扩增显示HBV DNA特异性条带.H9101细胞具端粒酶活性,是细胞连续传代和建系的保证;它恶性程度高、整合HBVDNA和具人肝细胞癌生物学基本特征,可为肝癌分子生物学研究提供有价值的实验材料.     

空泡形成毒素影响禽致病性大肠杆菌的生物学特性及致病性

摘要:【目的】构建禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)菌株APEC-O1空泡形成毒素(Vacuolating autotransporter toxin,Vat)基因缺失株,研究该基因对APEC-O1生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建vat 缺失株,并利用低拷贝质粒pSTV28构建互补株,然后比较野生株、vat缺失株与互补株在生长特性、运动性、凝集沉淀能力、生物被膜、致病性等生物学特性的差异。【结果】vat基因缺失不影响APEC-O1的生长速度及抗环境压力能力,但缺失vat导致APEC-O1运动能力增强,而使生物被膜形成能力、凝集沉降能力、致病力、体内存活能力均显著性减弱。【结论】Vat缺失影响APEC-O1运动能力、凝集沉淀能力、生物被膜形成能力及致病力,为全面了解Vat 的致病作用提供参考。     

EB病毒与子宫颈癌发病的关系

目的 分析EB病毒感染与子宫颈的关系及其对抑癌基因p53表达的影响,探讨EB病毒的致癌机制。方法 采用免疫组织化学S-P法,分别检测59例宫颈鳞癌,19例正常宫颈组织的EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）及抑癌基因p53蛋白的表达情况,并进一步分析宫颈癌组织EBV感染与抑癌基因p53表达的关系。结果 EBV阳性表达率在宫颈癌及正常宫颈组分别为64．4％和21．1％,2组间差异有显著性（P〈0．05）;p53在宫颈癌组织中的阳性表达率为64．4％,明显高于正常宫颈组26．3％,（P〈0．05）。EBV感染与非感染的宫颈癌组织中,p53的阳性表达率分别为78．9％与38．1％,2组间差异有显著性（P〉0．05）。结论 EBV病毒感染与宫颈癌的发病密切相关,但其机制可能是通过影响抑癌基因P53表达而致癌。     

猪流行性腹泻病毒地方株LJB/03分离及培养特性

从黑龙江省某猪场疑为病毒性腹泻的发病猪采集腹泻粪便样品,以RT-PCR法扩增出猪流行性腹泻病毒M基因后,采用细胞培养法进行病毒分离。对细胞培养分离物进行间接免疫荧光、免疫电镜观察、RT-PCR及ELISA法检验,其中间接免疫荧光试验可见培养细胞中存在明显的特异性绿色荧光;免疫电镜下可见大小符合预期、有囊膜、花瓣状的典型冠状病毒结构特征;RT-PCR检测证实存在PEDVM基因;间接ELISA检测中平均P/N比值为7.6;从而确认为分离到一株猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),命名为PEDVLJB/03株。随后,对该分离毒株的培养特性及如何提高病毒滴度进行探索。通过摸索该分离毒株的蚀斑形成条件,建立了PEDV蚀斑形成方法,并采用该方法进行病毒的蚀斑纯化,纯化得到PEDV大蚀斑克隆株和小蚀斑克隆株。对大、小两种蚀斑克隆株的病毒滴度测定结果表明,大小蚀斑克隆株细胞感染滴度相差明显。