猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列的表达与纯化

猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)基因的cDNA去除信号肽后PCR扩增出成熟蛋白编码序列1．2kb片段,将该片段与pMD18-T载体连接。转化JM109受体菌细胞;筛选阳性克隆测序分析,结果表明与设计序列完全一致。将该克隆载体的质粒DNA用带有BamHI和Sall内切酶识别序列的另一对引物进行PCR扩增,将回收的1.2 kb PCR目的片段定向克隆到pET28a( )表达载体上。成功地构建了编码绪肌生成抑制素成熟蛋白的原核表达载体。LB液体培养基中用IPTG诱导表达,SDS—PAGE显示重组菌表达的MSTN蛋白以包涵体形式存在;经薄层扫描仪扫描分析SDS-PAGE凝胶,表达的MSTN包涵体蛋白占菌体不溶性蛋白含量的27．9％,其相对分子质量为41451．3。所构建的表达载体中含六聚组氨酸标签,HisTrap亲和柱纯化后纯度可达92．5％。该试验为获得较好的绪肌生成抑制素并制备抗体打下了良好的基础。     

猪肌肉生长抑制素基因侧翼区新微卫星标记的鉴定及分析

提取包含猪肌肉生长抑制素基因的BAC克隆,以EcoRⅠ进行酶切并回收其中大于4kh的酶切产物,连接到pGEM-3zf( )载体后得到了亚克隆。测序分析表明,插入片段不属于猪肌肉生长抑制素基因的一部分,但其中包含13拷贝的(TG)n重复。以该重复序列的侧翼设计引物对猪的基因组进行分析,得到了PCR扩增产物。对一个“双肌臀”大白猪家系进行PCR扩增及非变性聚丙烯酰胺凝胶分析的结果表明,该位点以并显性方式遗传,是一个新的微卫星标记。对莱芜猪、长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、民猪和二花脸7个品种的381个无关个体的检测均显示该基因座只有两个等位基因,重复数分别为13和19,是一种多态性较低的微卫星标记。与包含该基因的序列(AY208121)比对分析表明,该微卫星属于肌肉生长抑制素基因(MSTN)侧翼区的一个分子标记,在猪肉用性状QTL的精细定位和MSTN功能分析中将发挥重要作用。     

不同品种猪肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性分析

用PCR-RFLPs和PCR-SSCP分析方法,对"双肌臀”大白猪、大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏、皮特兰、二花脸、东北民猪、湖北白猪和部分杂交猪等不同品种猪肌肉生长抑制素基因3＇编码区、5＇调控区及内含子1区3个单核苷酸多态性位点(SNPs)进行了分析.结果表明,3＇编码区的SNP发生的频率较低,在274头猪中未检出突变纯合体.对5＇调控区的SNP,引进猪种(大白猪、长白猪、杜洛克、汉普夏和皮特兰)及其杂交猪以等位基因T为主,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01).东北民猪的3种基因型近乎相等,处于Hardy-Weinberg衡状态.对内含子1区的SNP,大白猪及其与长白猪的杂交猪等位基因G占优势,二花脸和湖北白猪则以等位基因A为主,均偏离Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01);东北民猪和大二猪的等位基因G和A近乎相等,处于Hardy-Weinberg平衡状态."双肌臀”大白猪在5＇调控区和内含子1区这两个位点的A等位基因稍高于普通大白猪.5＇调控区和内含子1区SNPs所产生的等位基因表现出连锁遗传现象.     

鳜肌肉生长抑制素Myostatin cDNA克隆与组织表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜(Siniperca chuatsi)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)cDNA序列,并分析了该基因的结构特征和亲缘关系。鳜MSTN cDNA序列全长2627bp,包括5′端非翻译区117bp、3′端非翻译区1376bp和开放阅读框(ORF)1134bp,共编码377个氨基酸,含22个氨基酸的信号肽。鳜MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析表明,鳜与其他鱼类聚为一支。RT-PCR分析表明,鳜MSTN在成体不同组织中的表达情况不同,其中,卵巢、肾、眼、肌肉、心、脑、皮肤和胃中有表达,肝胰脏未见表达。     

草鱼两个肌肉生长抑制素cDNA克隆、表达及过量表达对胚胎发育的影响

肌肉生长抑制素(MSTN)是抑制肌肉生长和发育的重要生长调控因子.通过cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆草鱼MSTN-1型和MSTN-2型全长cDNA.RT-PCR分析结果表明,MSTN-1在草鱼肌肉、脑和眼中的转录量较高,在肝胰脏、脾脏和心的转录量较低,在肠、腮、性腺和肾中无表达;MSTN-2只在脑和肌内中有表达.在草鱼胚胎发育的0-36 hpf期间,MSTN-1的转录量较低;在胚胎发育的36-48 hpf期间,其转录量呈逐渐升高的趋势;MSTN-2各时相均无表达,可能因为该基因在草鱼胚胎发育过程中不起重要作用.通过分别显微注射MSTN-1型和MSTN-2型mRNA至斑马鱼1-2细胞期胚胎.结果显示,注射MSTN-1型mRNA过表达可导致斑马鱼体节发生期胚胎的前-后轴拉长,背-腹轴变短,脊索轻微扭曲,以及体节发育受到强烈抑制而不分化等现象.注射MSTN-2型mRNA胚胎早期发育有所延迟并未发生明显变化,但发育至60h之后尾部明显发生严重弯曲.     

肌肉特异性激酶基因的克隆、表达和纯化

目的:克隆小鼠肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)基因,原核表达、纯化MuSK蛋白。方法:获取编号AY360453的小鼠肌肉特异性激酶的基因编码序列进行优化和合成,将得到的目的基因构建于大肠杆菌表达载体pQE30中,获得重组表达载体pQE30-MuSK,转化至大肠杆菌菌株M15中表达,SDS-PAGE凝胶电泳检测是否有目的蛋白条带,MuSK酶联免疫分析试剂盒检测目的蛋白的免疫活性及其含量。结果:获得MuSK基因1.4kb片段,成功构建pQE30-MuSK原核表达载体,MuSK蛋白在大肠杆菌中成功表达,相对分子质量约为48kDa,Elisa试剂盒测得样品中MuSK的含量约为8.2pmol/L。结论:利用分子克隆技术建立了MuSK基因的原核表达系统,为更深入的研究其在重症肌无力中的作用打下基础。     

鲤鱼肌肉生长抑制素基因(MSTN)的克隆及其组织表达特征

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子,对MSTN的研究将有助于促进动物生产。鲤鱼是我国的主要淡水养殖对象之一。因此,我们采用RT-PCR方法克隆了鲤鱼MSTN cDNA(No.EF551058)的部分序列,长度为921bp,编码306个氨基酸残基。鲤鱼MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和9个保守的半胱氨酸残基。多重序列比较发现其与斑马鱼GDF8有极近的亲缘关系,96.7%的氨基酸序列同源。不同组织的RT-PCR分析发现鲤鱼MSTN主要在肌肉和脑部表达,而其他所检测组织未见表达。鲤鱼MSTN不仅在肌肉生长发育中发挥作用,可能在神经系统发育中也有其作用。     

猪肥胖基因cDNA的克隆与分析

肥胖基因（ａｂ）是近年刚被克隆的新基因,该基因产物Ｌｅｐｔｉｎ是反映体内脂肪含量和调节体重的重信号因子,首次报道猪ｏｂ基因全长序列,并对不同种物ｏｂ基因的同源性进行了比较,以λＵｎｉ－ＺＡＰ＾ＴＭ为载体构建了猪脂肪ｃＤＮＡ文库,根据已知的人和鼠ｏｂ基因序列设计ＰＣＲ引物,利用ＰＣＲ法筛选猪脂肪ｃＤＮＡ文库,并用ＲＴ－ＰＣＲ从脂肪ＲＮＡ中扩增的３６６ｂｐ猪ｏｂ基因片段作探针,获得了全长３２７７ｂｐ的     

猪肌肉生长抑制素基因5′调控区T→A突变与生长性状的关系分析

生长速度是猪育种中选择的主要目标性状之一,鉴定影响生长速度的QTL或基因具有重要的实践意义和理论价值.对猪肌肉生长抑制素基因(myostatin,MSTN)5′调控区TA突变与生长性状的关系进行了分析.突变所产生的基因型的判定采用PCR-RFLP方法进行.猪生长性状的测定指标包括60日龄体重(body weight at 60d,BW60)、前期平均日增重(average daily gain of stage one,ADG1)、后期平均日增重(average daily gain of stage two,ADG2)和全期平均日增重(average daily gain of whole stage,ADG),所采用的记录数分别来自165,276,275和275头无亲缘关系个体.采用SAS软件包的GLM程序对MSTN基因型与猪生长性状的关系进行分析.结果表明,MSTN基因型对猪BW60,ADG1和ADG2的效应不显著(P＞0.1),对ADG2的效应在剔除基因型与品种的互作效应以后几乎达到显著水平(P＝0.0522),突变等位基因的携带者(基因型为TA)具有较高的后期平均日增重.     

猪肌肉生长抑制素基因5‘调控区T→A突变与生长性状的关系分析

生长速度是猪育种中选择的主要目标性状之一,鉴定影响生长速度的QTL或基因具有重要的实践意义和理论价值。对猪肌肉生长抑制素基因（myostatin,MSTN)5‘调控区T→A突变与生长性状的关系进行了分析。突变所产生的基因型的判定采用PCR－RFLP方法进行。猪生长性状的测定指标包括60日龄体重（body weight at 60d,BW60)、前期平均日增重（average daily gain of stage one,ADG1)、后期平均日增重（average daily gain of stage two,ADG2)和全期平均日增重（average daily gain of whole stage,ADG),所采用的记录数分别来自165．276,275和275头无亲缘关系个体。采用SAS软件包的GLM程序对MSTN基因型与猪生长性状的关系进行分析。结果表明,MSTN基因型对猪BW60（P＝0．0522）,突变等位基因的携带者（基因型为TA）具有较高的后期平均日增重。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

猪脂肪及肌肉组织中基因表达信息分析

为探测猪脂肪及肌肉组织中基因表达概况,利用猪EST资源和人类基因序列开展计算机模拟研究,旨在为猪肉质改良的遗传基础分析提供候选信息。执行Blast比对程序以识别人类基因组基因与猪EST序列间的同源性并筛选出高度同源记录,同时编制4个Java程序进行序列检索收集、序列比对结果的过滤筛选以及分类处理。统计分析表明：至少有2002个基因在猪脂肪及肌肉组织中表达,其中1087个基因在脂肪组织表达,1205个基因在肌肉组织中表达,两组织共同表达的基因为290个;筛选出高同源基因,同时分类统计出了114个基础活性基因(脂肪和肌肉组织分别表达80和34个),并选取Top记录进行了描述分析和总结。     

Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中的表达

本研究采用免疫荧光及免疫组化DAB显色技术来检测Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的骨骼肌中的定位和表达情况,并通过平均光密度统计分析Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪骨骼肌中表达水平.结果表明:Myogenin蛋白表达定位于骨骼肌细胞核表达;在五指山猪和长白猪胎儿和成年猪的腿部骨骼肌和背部骨骼肌中均检测到阳性产物,在猪胎儿期间骨骼肌中Myogenin蛋白的表达水平高于其在成熟猪骨骼肌中的表达;且在同种猪腿部骨骼肌中的表达水平显著高于其在背部骨骼肌中的表达;此外还检测到Myogenin蛋白在五指山猪骨骼肌中表达均显著高于其在长白猪骨骼肌中的表达(p<0.05).本研究得到的Myogenin蛋白在五指山猪和长白猪骨骼肌中存在显著的表达差异结果,为今后研究不同猪种间骨骼肌发育差异及探讨五指山猪矮小机制和发育机理提供了理论基础.     

乌金猪FTO基因的克隆和表达分析

目的:克隆乌金猪脂肪和肥胖相关基因(FTO)编码区序列(CDS),分析其序列组成特征及在乌金猪不同组织中的表达情况。方法:采用反转录PCR方法从乌金猪脂肪组织中克隆FTO基因CDS,利用生物信息学方法分析其序列组成特征;采用实时PCR方法分析乌金猪FTO基因mRNA在不同组织中的表达情况。结果:克隆的FTO基因全长1518 bp(已提交至GenBank数据库,登录号为JQ031263),编码由505个氨基酸残基构成的蛋白,推测的相对分子质量为58.16×103,等电点为5.18;乌金猪与牛、羊、人和大鼠的FTO蛋白的氨基酸序列同源性分别为91%、90%、89%和83%;进化树分析显示,推测的乌金猪FTO蛋白的氨基酸组成与牛、羊的亲缘性较近,其次是人、大鼠;推测的氨基酸组成中无跨膜区,无信号肽,为亲水蛋白;分析发现该蛋白有22个磷酸化修饰位点,包括10个丝氨酸蛋白激酶磷酸化位点、7个苏氨酸蛋白激酶磷酸化位点、5个酪氨酸蛋白激酶磷酸化位点,200、246、302位氨基酸残基有糖基化位点;二级结构预测发现该蛋白共有201个螺旋、33个伸展链和271个卷曲结构;实时PCR检测的组织表达谱表明,FTO基因mRNA在乌金猪肝脏组织中的表达量最高,在脂肪、肾、脾中也有大量表达,在心脏、肌肉中的表达量最少。结论:为深入探讨乌金猪FTO基因的生物学功能奠定了重要基础。     

巴马香猪和杜长大猪的PDK4基因的克隆及组织表达分析

为了获得广西巴马香猪和杜长大猪丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)基因编码区序列(CDS),并研究PDK4基因在广西巴马香猪和杜长大猪不同组织中的mRNA表达差异,本研究利用基因克隆技术分别从巴马香猪和杜长大猪的背最长肌组织中提取总RNA,PCR扩增出PDK4基因CDS,并进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测PDK4基因在这两品种猪不同组织中m RNA的相对表达量。结果表明:本研究分别成功克隆获得巴马香猪和杜长大猪PDK4基因CDS,长度为1 224 bp,这两品种猪的PDK4基因CDS同源性为100%,与GenBank报道的普通猪、人、鼠、马、羊的同源性分别为100%、91.0%、85.5%、92.3%、93.0%。基于PDK4基因碱基同源性构建的物种系统进化树可知,巴马猪和杜长大猪遗传距离是最近的,最远的是小鼠。两品种猪PDK4氨基酸组成中亮氨酸含量较高,占总氨基酸数的10.8%,同时发现PDK4蛋白具有较强的亲水性。巴马香猪和杜长大猪PDK4蛋白的高级结构中均包含有α螺旋、无规卷曲和延伸链。实时荧光定量PCR结果显示,巴马香猪和杜长大猪的不同组织PDK4基因表达量最高的为腹脂,最低的是脾。巴马香猪背最长肌中PDK4基因表达水平极显著高于杜长大猪,而杜长大猪的皮脂、腹脂、肝、脾以及肾中PDK4基因表达水平极显著高于巴马香猪。本试验成功克隆了巴马香猪和杜长猪的PDK4基因,并且检测了该基因在两品种猪不同组织中的基因表达水平的差异,为今后深入探讨PDK4基因在地方猪种脂质代谢和脂肪沉积方面发挥的作用奠定工作基础。     

猪JARID1C基因的cDNA克隆、生物信息学及组织表达谱分析

JARID1C是高度保守的ARID蛋白家族的成员,该家族的蛋白参与并引起一系列生物学效应,如染色质重塑、细胞增殖与分裂、个体发育以及基因转录调控。JARID1C在人脑中表达丰富,对脑的发育和维持正常功能具有重要作用,突变可引起智力迟钝。本研究采用电子克隆（insilicocloning）的方法并结合5′末端快速扩增技术（RACE）,从猪卵巢中克隆到JARID1C的全长cDNA序列（GenBank登录号：EF139241）。猪JARID1C基因的cDNA全长5,908bp,包括4,551bp的开放阅读框（ORF）、522bp的5′非翻译区（5′UTR）和835bp的3′非翻译区（3′UTR）,polyA加尾信号序列AATAAA位于5,881bp和5,886bp之间。生物信息学分析揭示JARID1C蛋白含有1517个氨基酸残基,定位于细胞核中,该蛋白含有5个保守的结构域：JmjN结构域、ARID结构域、JmjC结构域、C5HC2锌指结构域和PHD锌指结构域。应用ClusterW程序分别对猪、狗、小鼠、大鼠、人和猿的JARID1C核苷酸序列和氨基酸序列进行多重序列比对,发现猪的JARID1C与其他哺乳动物具有很高的相似性。借助Mega3.1软件,采用N-J算法构建JARID1亚家族蛋白的系统进化树,揭示不同物种的进化关系。应用实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同组织的表达差异,结果表明该基因在各组织均不同程度地表达,其中在肺和骨骼肌表达水平最低,而在脑和性腺表达水平最高。     

细菌视紫红质的基因克隆与表达

细菌视紫红质的基因克隆与表达卢春林,汪俭,梅祺,韦钰（东南大学吴建雄实验室,南京２１０Ｏ１８）叶寅,田波（中国科学院微生物研究所,北京１０００８０）关键词细菌视紫红质基因;聚合酶链反应（ＰＣＲ）;基因克隆与表达细菌视紫红质（ｂａｅ快ｒｉｏｒｈｏｄｏＰ...     

链霉菌酪氨酸酶基因的克隆与表达

本文综述了近年来对链霉菌酪氨酸酶基因的研究。由酪氨酸酶合成黑色素是链霉菌属各个种的共同特性,并受到酪氨酸酶基因的控制。链霉菌几个种的酪氨酸酶基因已克隆到,其产黑色素的特性使之作为重要的标记基因得以广泛应用,同时,该基因在链霉菌的不同种及不同属的微生物中得到了高水平的表达。链霉菌酪氨酸酶基因表达调控的分子机制也得到较深入的研究。     

Molecular Cloning and Expression Analysis of Pig Cd90

The CD90 (Thy-1) is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored glycoprotein that transfers signals involved in many biological events including cell activation, cell migration, cell adhesion, and tumor suppression. In this study, we cloned pig CD90 cDNA and determined its complete cDNA sequence. Pig CD90 cDNA contained an open reading frame (486 bp) encoding 161 amino acids with three putative N-glycosylation sites and four well-conserved cysteine residues, which form a possible disulfide bond within the extracellular domain among mammalian species. Pig CD90 mRNA was detected in various tissues, indicating the multicellular functions of CD90 in pigs. Flow cytometry analyses demonstrated that anti-human CD90 antibody recognizes a pig CD90 on the cell surface. Moreover, immunohistochemistry analysis revealed that CD90 expression is widely diffused in several pig tissues. Further studies will be necessary to define the functional contribution of CD90 during specific infectious diseases in pigs.     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪（BaMei）肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokine signaling -2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明：首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列（GenBank登录号为EF121242）,其长度为822 bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。