植物二氢黄酮醇4-还原酶基因的研究进展

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花青素合成途径的关键酶,在花色的修饰中起重要作用。我们简述了DFR基因及其调节基因的研究进展,构建的系统进化树体现了部分单子叶与双子叶植物间的亲缘关系与进化差异,阐述了DFR调控基因的调控机制及DFR基因的应用前景。     

高等植物二氢黄酮醇4-还原酶基因研究进展

花青素苷是影响植物花瓣呈色的重要色素,而花色是决定花卉观赏价值和商业价值的一个重要因素。在花青素苷的生物合成过程中,二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花青素苷生物合成下游途径中的第一个关键的酶。因此,DFR在高等植物花色的形成过程中发挥极其重要的作用,是形成花青素苷的一个非常重要的调控点。DFR对3种二氢黄酮醇底物具有选择特异性,但决定DFR底物特异性的分子机制目前仍不十分清楚。该文简单概述了花青素苷生物合成途径及其转录调控机制,并结合作者的工作重点综述了DFR的底物特异性以及克隆的DFR基因在植物基因工程中的应用。     

牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。本研究以牡丹品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹DFR基因cDNA全长,命名为PsDFR1,GenBank登录号为HQ283448。序列分析结果表明,PsDFR1全长1242bp,包含一个长为1095bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。生物信息学分析显示该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,包括多个保守的短链脱氢/还原酶家族的特征位点,属于NADB_Rossmann超家族。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,PsDFR1与葡萄、棉花、毛果杨、梨等植物的DFR相似性都在75%以上。实时荧光定量PCR分析表明,PsDFR1在花色素大量积累的花瓣中表达量最高,其次是萼片和雄蕊,再次是叶片,在心皮中表达量最低。     

蓝粒小麦花青素生物合成途径中的二氢黄酮醇4-还原酶基因的分子克隆

蓝色色素在蓝粒小麦种子糊粉层中的生物合成途径的分子生物学机制至今仍不清楚.应用RT-PCR和RACE方法从蓝粒小麦正在发育的种子中克隆到一个编码二氢黄酮醇4-还原酶的基因(DFR).推测其为花青素生物合成途径中的一个关键基因,且与蓝粒小麦中蓝色色素形成密切相关;其开放阅读框编码一个包含354个氨基酸残基的多肽,与一些从其他植物中已克隆到的DFR有很高的同源性:大麦(94%)、水稻(83%)、玉米(84%).从长穗偃麦草(2n=70)、蓝粒小麦、浅蓝粒小麦自交产生的白粒后代小麦以及中国春的基因组中分别分离到一个全长DFR序列.经聚类分析表明DFR cDNA核甘酸序列与从中国春基因组中克隆的DFR具有100%的同源性,且与长穗偃麦草、蓝粒小麦、白粒小麦基因组中分离的DFR均有很高的同源性.4个DFR基因组DNA均含有3个内含子,且它们之间的差异主要在内含子区,表明该基因在进化上很保守.经Southern杂交分析,DFR在小麦中至少有3～5个拷贝,不同小麦材料间未见明显差异,但与长穗偃麦草有明显差异,属于一个DFR超基因家族.Northern分析表明该DFR在蓝粒和白粒种子的不同发育时期的表达存在明显差异,都在开花后大约18 d表达最强,在同一时期的蓝白种子中,DFR在蓝粒种子中的表达量高于白粒.DFR转录本在小麦和长穗偃麦草的幼叶中积累多,但在芽鞘中的表达显著低于幼叶中;在小麦的根和长穗偃麦草的发育种子中均未检测到DFR的表达.推测蓝粒小麦中可能存在调控DFR在蓝粒小麦中表达的调控基因,类似于玉米花青素合成途径中的调节基因.     

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶的原核表达与多克隆抗体制备

苦荞二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花青素合成途径的关键酶。该研究以苦荞种子灌浆期cDNA为模板,采用RT-PCR方法克隆苦荞DFR编码基因,并将其连接到表达载体pET47b上,转化获得苦荞DFR编码基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,通过IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物,用亲和层析方法纯化蛋白,制备苦荞DFR多克隆抗体。RT-PCR技术获得了苦荞DFR编码基因的开放阅读框,重组表达载体经PCR和测序鉴定,表明表达载体构建成功,SDS-PAGE分析表达产物分别以可溶和不可溶的形式高效表达,亲和层析纯化得到融合蛋白,Western blotting显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的苦荞DFR蛋白在苦荞种子灌浆期中大量表达。苦荞DFR编码基因的原核表达与多克隆抗体的制备,为进一步开展DFR编码基因功能的研究奠定了基础。     

七彩红竹二氢黄酮醇4-还原酶基因IhDFR1的克隆及表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）是植物花色素苷合成途径中的关键酶,在植物花色的形成过程中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物,采用ImPcR技术从七彩红竹中克隆获得了一个新的DFR基因cDNA全长,命名为IhDFR1（登录号为KF728205）。序列分析结果表明,IhDFR1基因cDNA全长945bp,编码314个氨基酸。生物信息学预测显示,该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域,存在2个特异结合位点,属于非Asn／Asp型DFR酶,与禾本科植物中的DFR具有较高的相似性。对不同发育时期七彩红竹的IhDFR1基因进行时空表达的结果显示,只有在竹秆颜色呈现红紫色时,IhDFR1基因才有表达。以上结果初步显示IhDFR1蛋白可能作为一个重要的酶参与竹秆花色素苷的代谢调控,同时为进一步研究七彩红竹花色素苷产生的分子机理和综合开发利用奠定了基础。     

基于转录组测序的细风轮花青素合成途径及关键酶基因分析

为进一步理解细风轮花青素合成途径,本研究利用华大基因BGISEQ-500平台对细风轮中的根、茎、叶、花4个组织进行了转录组测序,从头组装后得到128 856个Unigene。KEGG通路表明有40个Unigene编码了细风轮的花青素生物合成途径中6个关键酶。我们对其中的关键酶DFR（二氢黄酮醇还原酶）进行同源比对和空间结构模拟,结果显示DFR序列和结构均具有良好的保守性,且具有高度保守的NAD⁺结合位点,其二级结构主要由α螺旋和β折叠组成,在空间上α螺旋包裹着β折叠,形成“夹心饼干”样结构。     

蓝粒小麦花青素生物合成途径中的二氢黄酮醇4-还原酶基因的分子克隆

蓝色色素在蓝粒小麦种子糊粉层中的生物合成途径的分子生物学机制至今仍不清楚。应用RT—PCR和RACE方法从蓝粒小麦正在发育的种子中克隆到一个编码二氢黄酮醇4-还原酶的基因(DFR)。推测其为花青素生物合成途径中的一个关键基因,且与蓝粒小麦中蓝色色素形成密切相关;其开放阅读框编码一个包含354个氨基酸残基的多肽,与一些从其他植物中已克隆到的DFR有很高的同源性：大麦(94％)、水稻(83％)、玉米(84％)。从长穗偃麦草(2n=70)、蓝粒小麦、浅蓝粒小麦自交产生的白粒后代小麦以及中国春的基因组中分别分离到一个全长DFR序列。经聚类分析表明DFR cDNA核甘酸序列与从中国春基因组中克隆的DFR具有100％的同源性,且与长穗偃麦草、蓝粒小麦、白粒小麦基因组中分离的DFR均有很高的同源性。4个DFR基因组DNA均含有3个内含子,且它们之间的差异主要在内含子区,表明该基因在进化上很保守。经Southern杂交分析,DFR小麦中至少有3-5个拷贝,不同小麦材料间未见明显差异,但与长穗偃麦草有明显差异,属于一个DFR超基因家族。Northern分析表明该DFR在蓝粒和白粒种子的不同发育时期的表达存在明显差异,都在开花后大约18d表达最强,在同一时期的蓝白种子中,DFR蓝粒种子中的表达量高于白粒。DFR转录本在小麦和长穗偃麦草的幼叶中积累多,但在芽鞘中的表达显著低于幼叶中;在小麦的根和长穗偃麦草的发育种子中均未检测到DFR的表达。推测蓝粒小麦中可能存在调控DFR在蓝粒小麦中表达的调控基因,类似于玉米花青素合成途径中的调节基因。     

二氢黄酮醇还原酶基因在红肉萝卜和白肉萝卜中的序列变异和表达差异

二氢黄酮醇还原酶是植物花青素合成的关键酶。本研究以中国特有红肉萝卜种质‘心里美’为试材,克隆和分析其二氢黄酮醇还原酶基因(DFR)。通过与大白菜DFR基因的完整CDS序列及白萝卜自交系‘36-2’全基因组序列(未公布)进行比对,获得单一的同源序列Rsa10008592。参照该序列设计5’和3’引物,以‘心里美’萝卜自交系‘HX12Q-49’的cDNA为模板,通过RT-PCR和TA克隆获得ORF为1164 bp(Genbank登录号KF280272)、编码387 aa(Genbank登录号AGU42192)的RsDFR基因的完整CDS序列。通过对白萝卜‘36-2’的Rsa10008592和‘心里美’萝卜‘HX12Q-49’的RsDFR序列比较分析,发现二者之间存在19个核苷酸和3个氨基酸的差异。氨基酸序列进化树显示,‘心里美’萝卜的RsDFR与大白菜和芥菜的DFR同源性较高。荧光定量PCR发现RsDFR在白萝卜和‘心里美’萝卜不同发育阶段的表达模式不同,在白萝卜中仅在肉质根发育的早期表达,而在‘心里美’萝卜的全生育期均有表达,且在破肚期的表达量最高。同时,对‘心里美’萝卜RsDFR基因编码的蛋白质进行了初步分析。     

园艺作物花青素合成调控研究进展

花青素是一类保护植物免受生物和非生物胁迫的重要次生代谢产物,因其赋予植物丰富的色彩和对人体的保健功能而受到广泛关注。花青素合成调控机理的相关研究是目前园艺作物分子生物学研究的前沿课题,对于园艺作物花青素含量的提高、种质品质的提升等具有重要的意义。结合国内外园艺作物中花青素生物合成调控方面的最新研究进展,介绍了环境因素、酶与激素、DNA甲基化与泛素化和调控基因等对花青素生物合成的作用,以及花青素抵御外界胁迫的功能机制,综述了近年来园艺作物中花青素生物合成调控的研究成果,以期利用基因工程为提升园艺作物的色彩丰富度提供理论参考。     

植物花青素合成相关的bHLH转录因子

花青素是由类黄酮途径一个特异的分支合成的,它不仅能够决定花和果实的颜色,还能保护植物免受各种生物和非生物胁迫损伤。bHLH转录因子广泛存在于植物中,在植物的生长发育与形态建成、次级代谢产物的合成及对外界环境胁迫应答中起着重要的调控作用。近年来,随着大规模基因组测序技术和分子生物学的发展,植物中越来越多的bHLH转录因子得到鉴定。本文主要对花青素合成相关的bHLH转录因子及其在调节结构基因表达和花青素合成中的作用进行了综述。     

二氢黄酮还原酶基因的克隆与转基因烟草的获得

以蒺藜苜蓿(Medicagotrunctulacv.5160)幼果总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA序列,所获得的cDNA序列全长1018 bp,具有完整的ORF,编码337个氨基酸。Blast分析表明,该片段与GenBank中注册的DFR基因同源性为99.80%。以植物表达载体pBI121为基础,构建了Ca MV35S启动子驱动的DFR基因植物表达载体pBIDFR;采用直接转化法将pBIDFR导入根癌农杆菌EHA105,用该菌株对普通烟草进行遗传转化获得6株转基因植株。     

植物花色素苷生物合成的转录调控

转录调节是植物花色素苷生物合成途径中调节其结构基因表达的重要环节之一。近十多年来,通过调节转录因子的表达激活或抑制有效地调控植物中花色素苷的合成成了众多植物学家研究的重点。现简要介绍了花色素苷的合成运输过程与液泡的沉积扣押、转录因子与调控及转录调节在遗传改良中的应用等方面的研究进展。     

ABA信号通路对葡萄果皮花青苷生物合成的调控机制研究

以'红巴拉多'葡萄为试验材料,在转色前期(约花后6周)用300 mg/L的ABA对果穗进行处理,以清水处理为对照;测定不同发育时期葡萄果实的单果重、可滴定酸、可溶性固性物等生理指标,同时测定果皮中总花青苷及ABA含量;检测不同发育时期果皮中ABA信号通路和花青苷生物合成相关基因表达量,克隆6个与花青苷生物合成相关基因的...     

宁夏枸杞DFR基因的克隆与序列分析

根据已报道植物二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)基因cDNA序列的保守区域设计引物,对宁夏枸杞(Lycium barbarum)DFR基因进行克隆及序列分析.结果表明,宁夏枸杞DFR基因cDNA全长1140个碱基,有一个1116个核苷酸的开放阅读框,编码一个长372个氨基酸的蛋白质;氨基酸序列的聚类分析显示,宁夏枸杞LbDFR1与马铃薯、烟草、蕃茄等茄科植物的DFR亲缘关系较近,其中与马铃薯DFR亲缘关系最近,相似性为92％;通过编码蛋白的三级结构预测,该蛋白为单体模式,具有酶学的生物特征;宁夏枸杞LbDFR1在宁夏枸杞的根、茎、叶等组织中广泛表达,为组成表达型基因.     

植物花青素合成代谢途径及其分子调控

植物花青素是一种天然食用色素,具有安全、无毒的特点,具有预防心脑血管疾病、保护肝脏与抗癌等多种重要的营养和药理功能。因此,花青素在食品、医药保健、园艺和作物改良等方面均具有重要研究价值和应用潜力。该文综述了植物花青素合成代谢途径及其分子调控研究进展,概述了植物花青素的生物合成、代谢以及积累过程,重点介绍了影响植物花青素代谢的结构基因和调控基因及其作用机制,同时展望了花青素合成代谢相关基因的研究应用前景和发展趋势。     

植物花青素生物代谢调控

花青素是一类重要的天然色素物质,是植物的主要呈色物质之一,近年来花青素在保健方面的作用越来越受到人们的重视,利用基因工程改造植物花青素相关基因,提高花青素含量已成为研究的热点领域。综述花青素的合成途径、调控机理及转基因方面的研究,重点介绍近年来影响花青素合成的分子因素及外部环境因素的研究现状。