中华蜜蜂气味结合蛋白基因AcerOBP7的克隆及序列分析

[目的]克隆中华蜜蜂(Apis cerana cerana) Acer OBP7基因并分析其相关生物学信息。[方法]收集中华蜜蜂样本,提取总RNA,反转录制备c DNA。设计特异性引物,PCR扩增Acer OBP7基因的ORF序列。利用多种生物信息学软件对编码蛋白的理化性质和结构特征进行预测和分析。[结果]获得中华蜜蜂气味结合蛋白基因Acer OBP7的c DNA序列。Acer OBP7基因的开放阅读框(ORF)长438 bp,编码145个氨基酸。存在信号肽,无跨膜结构,在53～140个氨基酸之间有一个昆虫气味结合蛋白家族的PBP-GOBP家族的保守结构域,信号肽源于氨基酸中的1～20位,其对应的剪切位点落在氨基酸中的20位与21位间。有一些相对清晰的疏水区。[结论]Acer OBP7蛋白属于Classical OBP亚家族,具有典型的PBP-GOBP家族结构,是一种分泌蛋白。     

休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）木糖醇脱氢酶基因（xyl2）克隆与序列分析

根据木糖醇脱氢酶基因序列相似的特点,根据树干毕赤酵母（Pichia．sfipitis）,热带假丝酵母（Candidatropicalis）设计1对简并引物获得C．shehatae HDYXHT－01木糖醇脱氢酶基因的序列,此片段长为1095bp。利用生物信息学软件对此序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、CDS分析、二级结构预测。结果表明,该克隆片段为C．shehataeHDYXHT－01木糖醇脱氢酶基因的序列。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

中国野葡萄新基因cDNA全长的克隆及序列分析

根据对中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下构建的cDNA文库中获得的1条EST序列设计特异引物,以总RNA逆转录产物为模板,进行SMART-RACE扩增。结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,并预测了蛋白质的理化性质、信号肽、酶与非酶分析、亚细胞定位以及蛋白质二级结构。结果表明,获得的中国野生葡萄新基因的全长序列为854 bp,其开放阅读框为585 bp,5′非编码区为107 bp,3′非编码区为162 bp;同源性比对表明该新基因推导的氨基酸序列与拟南芥RNA结合蛋白和水稻推定的半乳糖基转移酶的同源性分别为55%和63%,第8~82位氨基酸序列与RNA识别基序相类似,是一个典型的结构功能域;推导该基因表达产物为相对分子质量为21 801.27、等电点为6.86的不稳定蛋白,定位于细胞核,不包含信号肽,二级结构主要是无规则卷曲。     

油菜蔗糖转化酶基因的电子克隆和生物信息学分析

运用电子克隆技术获得油菜中一个蔗糖转化酶基因eDNA序列,同时根据此段序列设计引物以油菜eDNA为模板进行扩增。经测序得到证实。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、基本理化性质、跨膜结构域、信号肽导肽、疏水性／亲水性、二级结构、亚细胞定位等方面进行了预测和分析。结果表明：该基因eDNA序列长度为2150bp,包含一个1779bp开放阅读框,编码592个氨基酸;该编码蛋白含有蔗糖转化酶的多个典型的保守结构域。同源比对分析显示,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥等植物的蔗糖转化酶基因具有高度的相似性,进一步确定该蛋白为蔗糖蛋白酶。研究结果为该基因进一步的实验克隆,表达分析,功能鉴定奠定基础。     

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1～5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3 277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactro...     

嗜水气单胞菌溶血素基因克隆与序列分析

[目的]对嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)进行克隆、序列分析和蛋白三级结构预测。[方法]根据嗜水气单胞菌溶血素基因(HlyA)设计特异性引物,采用PCR方法扩增并亚克隆至pMD18-T载体中,进行DNA测序分析。[结果]获得Hly A基因片段大小为1 022 bp,推导编码297个氨基酸,其中1-30aa区域为信号肽序列,7-196aa区域为溶血素-N端结构域(PF12563),222-297aa区域为杀白细胞素结构域(PF07968)。HlyA蛋白三级结构与模板(PDB:1XEZ_A)相似性达41.76%,主要由β折叠、转角构成,与拉马钱德兰图方法检测Hly A蛋白空间结构基本一致。[结论]该研究有助于理解嗜水气单胞菌Hly A基因功能及其溶血机制。     

野生黄花苜蓿冷诱导基因克隆及序列分析

根据紫花苜蓿抗寒基因cas15B(登录号:L12462)的cDNA序列,设计1对特异引物,以经过低温胁迫的黄花苜蓿总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得了550bp的cDNA片段。测序和序列分析结果表明,扩增片段长度为550bp,编码159个氨基酸。主要由Gly(甘氨酸)、Glu(谷氨酸)、His(组氨酸)、Lys(赖氨酸)这4种氨基酸组成,占总量的70%。含1个重复了5次的10肽基序,其序列为Lys-Gly-Glu-Gln-His-Gly-His(Phe)-Val(Leu)-Gly-Gly。经序列比较分析,该片段与紫花苜蓿冷诱导基因CAS15B的核苷酸、氨基酸的同源性均为90%,命名为MfCAS15-1。亚细胞结构定位分析结果显示,MfCAS15-1是一种定向到核的蛋白,在调节或维持核的结构与功能方面起作用。本研究在黄花苜蓿中成功获得了抗寒基因同源序列,为最终克隆黄花苜蓿MfCAS15-1抗寒基因全长奠定了基础。     

血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)漆酶基因的克隆与序列分析

为克隆血红密孔菌 (Pycnoporussanguineus)漆酶基因 ,根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计了 1对简并引物 .以血红密孔菌基因组DNA为模板 ,PCR扩增出长 12 2 7bp的漆酶基因片段 .以此序列为基础 ,通过 5′及 3′RACE技术克隆出漆酶全长cDNA序列 ,序列长为 190 2bp ,其 5′端和 3′端非编码区长分别为 5 1bp和 2 97bp ,开放阅读框长 15 5 4bp ,编码 5 18个氨基酸的蛋白 .该蛋白具有 4个铜离子结合区域 ,预测其相对分子量为 5 6 313 2 ,等电点为 5 5 9,其氨基酸序列与Pycnoporuscinnabarinus漆酶 (lcc3 2 )的同源性最高 ,为 96 % .以该cDNA编码区的两端序列为引物 ,PCR扩增得到漆酶的长度为 2 15 4bp的全长DNA序列 ,序列中包括 10个内含子序列 ,长为 5 2～ 70bp     

绵羊BTG1基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

B细胞易位基因1(BTG1基因)是BTG/TOB基因家族的成员之一,在动物细胞的增殖和分化中起重要的作用．利用牛BTG1基因的mRNA序列与绵羊的EST数据库进行Blast检索,并通过序列拼接和逆转录RT-PCR方法首次获得绵羊BTG1基因的部分cDNA序列（GenBank登录号FJ444829）,其片段长度为1 358 bp,包括完整的开放阅读框516 bp,编码171个氨基酸．半定量PCR研究结果表明：BTG1基因在小尾寒羊和陶赛特羊的10种组织中均表达,并具有一致的表达趋势．同源分析结果表明,绵羊BTG1蛋白的氨基酸序列中存在BTG/TOB的保守结构域,并且该蛋白在不同物种间具有很高的保守性．通过生物信息学预测BTG1蛋白功能,发现绵羊BTG1蛋白存在1个跨膜结构域、8个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点．蛋白质结构同源建模分析表明,绵羊BTG1蛋白具有BTG/TOB蛋白家族的典型空间结构．     

High-throughput PCR screening of genes for three-component regulatory system putatively involved in quorum sensing from low-G + C gram-positive bacteria

Quorum sensing of gram-positive bacteria is often regulated by three-component regulatory system composed of autoinducing peptide, sensor kinase and response regulator. We used PCR to study a gene cassette encoding this three-component regulatory system. Degenerate primers were designed from consensus amino acid sequences in the HPK10 subfamily, mostly involved in quorum sensing. Products amplified from genomic DNA of Lactobacillus, Enterococcus, and Clostridium species were cloned and sequenced; their deduced amino acid sequences were similar to those of members of the HPK10 subfamily. Complete genes for the putative gene cassette were cloned by inverse PCR from L. paracasei E93490 and L. plantarum WCFS6. Phylogenetic analysis grouped the cloned putative HPKs into the HPK10 subfamily. These results indicated the usefulness of this high-throughput gene screening and suggested that the three-component regulatory gene cassette are widely present.     

树干毕赤酵母(Pichia Stipitis)木糖还原酶(xyl1)基因克隆与序列分析

根据木糖还原酶基因序列相似的特点,设计一对引物获得Pichia stipitis CICC1960的一段基因片段,此片段长度为957bp,共编码318个氨基酸.利用生物信息学软件对该序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、CDS 分析及二、三级结构预测.结果表明该片段为Pichia stipitis CICC1960木糖还原酶基因序列.     

甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

非核糖体肽合成酶基因腺苷酰化结构域序列克隆及分析

微生物许多非核糖体肽类次生代谢产物主要是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成。参考Gontang发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)通用引物设计扩增NRPS腺苷酰化结构域基因序列的特异引物,从海洋链霉菌L1的基因组DNA中扩增获得一个715 bp的NRPS基因序列。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS腺苷酰化结构域部分序列。对其拟翻译的氨基酸序列组成成分、理化性质进行分析,显示其包含AFD class I超基因家族核心结合区,为NRPS腺苷酰化结构域(A结构域)所在区域。对氨基酸序列的二级结构预测和三级结构模拟,发现与数据库中肠菌素合酶F组分的结构相似。为后续研究A结构域的特异性及完整NRPS基因簇克隆提供了参考。     

Synthesis of gamma-aminobutyric acid by lactic acid bacteria isolated from a variety of Italian cheeses

The concentrations of gamma-aminobutyric acid (GABA) in 22 Italian cheese varieties that differ in several technological traits markedly varied from 0.26 to 391 mg kg(-1). Presumptive lactic acid bacteria were isolated from each cheese variety (total of 440 isolates) and screened for the capacity to synthesize GABA. Only 61 isolates showed this activity and were identified by partial sequencing of the 16S rRNA gene. Twelve species were found. Lactobacillus paracasei PF6, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus PR1, Lactococcus lactis PU1, Lactobacillus plantarum C48, and Lactobacillus brevis PM17 were the best GABA-producing strains during fermentation of reconstituted skimmed milk. Except for L. plantarum C48, all these strains were isolated from cheeses with the highest concentrations of GABA. A core fragment of glutamate decarboxylase (GAD) DNA was isolated from L. paracasei PF6, L. delbrueckii subsp. bulgaricus PR1, L. lactis PU1, and L. plantarum C48 by using primers based on two highly conserved regions of GAD. A PCR product of ca. 540 bp was found for all the strains. The amino acid sequences deduced from nucleotide sequence analysis showed 98, 99, 90, and 85% identity to GadB of L. plantarum WCFS1 for L. paracasei PF6, L. delbrueckii subsp. bulgaricus PR1, L. lactis PU1, and L. plantarum C48, respectively. Except for L. lactis PU1, the three lactobacillus strains survived and synthesized GABA under simulated gastrointestinal conditions. The findings of this study provide a potential basis for exploiting selected cheese-related lactobacilli to develop health-promoting dairy products enriched in GABA.     

Cloning and characterization of a gene, mpsA, encoding a protein associated with intracellular magnetic particles from Magnetospirillum sp. strain AMB-1

Proteins located within the lipid bilayer, surrounding the intracellular bacterial magnetic particles (BMP) from Magnetospirillum sp. AMB-1, were separated using SDS-PAGE. Several major proteins of approximate molecular weight 66.2, 35.6, and 24.8 kDa were identified. The N-terminal amino acid sequence of one of these proteins, designated MpsA, was determined and used to design a pair of PCR primers which amplified a 105 bp DNA fragment from AMB-1 genomic DNA. Gene-walking, using anchored PCR, was used to determine the complete nucleotide sequence (954 bp) of the mpsA gene. The mpsA encodes a 317 amino acid protein which does not have an N-terminal cytoplasmic transport signal sequence. Intracellular localization studies were carried out using an mpsA-luc gene fusion expressed in AMB-1 following gene transfer by conjugation. The gene fusion was constructed by cloning a 1.6 kb mpsA fragment upstream of luc in the conjugal plasmid pKLC. The MpsA-Luc fusion protein was preferentially located on the magnetic particle membrane. Although the function of MpsA remains unknown, homology searches suggest similarity with the alpha subunit of acetyl-CoA carboxylase and the CoA-binding motif.     

大白菜雄性不育系RC7育性相关基因克隆与特性分析

根据orf138的保守序列设计引物,以大白菜萝卜胞质雄性不育系RC7的mtDNA为模板进行PCR扩增,扩增出大小为588 bp的特异条带,该片段在叶片和花蕾中均有表达,没有转录后加工,可编码75个氨基酸,定名为orf75。同源性分析结果表明:orf75推导的氨基酸序列N末端与萝卜Ogu CMS所具有的ORF138一致性为100%,有28个氨基酸完全相同,C末端与钾依赖钠钙交换蛋白-1一致性为54%。初步认为,orf75可能是orf138与钾依赖钠钙交换蛋白-1的编码基因发生重排产生的新的开放阅读框。RC7的不育性与Ogu CMS具有相似性。该588 bp片段还可编码1个含有1个疏水基团和1个跨膜区的67aa的蛋白片段,定名为orf67,属可溶性蛋白。     

小菜蛾乙酰胆碱酯酶cDNA片段的克隆和序列分析

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法对小菜蛾Plutella xylostella的乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简并性上游引物和下游引物扩增出了小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因281bp的cDNA片段。同源性分析表明, 该cDNA片段与其它昆虫乙酰胆碱酯酶基因序列具有较高的同源性。