二化螟β1微管蛋白基因cDNA序列的克隆与序列分析

微管是真核生物体内分布最为广泛的一类蛋白,是由a-和β-两种不同的微管蛋白组成的异源二聚体.微管参与许多细胞功能,如细胞形态发生、细胞生长和分裂等.以二化螟3龄幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),扩增得到该虫的β微管蛋白基因的cDNA序列一条.cDNA序列含1 862个碱基,开放读码框1 344个碱基,编码氨基酸447个,分子量约为50.2kD,等电点4.82.氨基酸序列中1～4个氨基酸MREI为β微管蛋白转录后调控信号,是微管蛋白特异片段;氨基酸序列的140～146GGGTGSG位存在一个微管蛋白标志信号片段.序列比对表明,克隆的β微管蛋白基因与其他昆虫的β微管蛋白基因在核苷酸和氨基酸水平上都是高度同源的,与家蚕Bombyx moriβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到99.1%,与烟草天蛾β1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到98.7%,与果蝇Drosophila melanogasterβ1微管蛋白的氨基酸序列同源性达到96.9%.该基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号为EU429675.     

小地老虎β-微管蛋白基因cDNA序列的克隆、序列分析和表达检测

β-微管蛋白在昆虫生长发育、信号传导、抗药性等方面具有重要作用.本研究以小地老虎Agrotis ypsilon(Rottemberg)3龄幼虫为材料,利用RT-PCR、cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到小地老虎β-微管蛋白基因的cDNA序列,命名为AgTubB(GenBank登录号:JN029962),并检测...     

三种鳞翅目夜蛾科昆虫α-微管蛋白基因的克隆与mRNA表达水平

根据昆虫微管蛋白的分子特征筛选对昆虫微管有效的抑制剂来控制昆虫的生长发育或不同器官的有效功能的表达来达到控制害虫的目的,在未来的害虫综合治理中具有广泛的应用前景。以预蛹期甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小地老虎Agrotis ypsilon和八字地老虎Agrotis c-nigrum为材料提取总RNA,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),分别扩增得到以上3种夜蛾科昆虫的α-微管蛋白基因的cDNA序列,3种昆虫的该基因序列均包括1个1353个碱基的开放阅读框。这3个cDNA序列均编码1个含450个氨基酸的蛋白,分子量约为50kDa。氨基酸的142~148位存在1个微管蛋白信号片段GGGTGSG,在氨基酸序列的C-端都有1个酪氨酸残基,N-端存在1个对转录后调控非常重要的保守区MRECI序列,以上特点与其他昆虫α-微管蛋白氨基酸序列保守区序列相同。序列比对表明,克隆得到的α-微管蛋白基因的核苷酸序列是高度保守的,同源性为94.4%~97.0%,而氨基酸的序列同源性达到100%。利用RT-PCR技术在3种昆虫4龄、5龄、6龄幼虫、蛹期4个不同发育阶段和6龄期的肠道、体壁、脂肪体3种不同组织中都检测到了α-微管蛋白基因在mRNA水平的表达。     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

小地老虎UV视蛋白基因的克隆及序列分析

视蛋白是感光物质的重要组成成分,是动物感知周围光环境的重要途径之一。本文以小地老虎(Agrotis ypsilon)3日龄成虫为材料,利用RT-PCR和RACE末端扩增技术克隆得到小地老虎UV视蛋白基因的cDNA序列。序列分析表明,小地老虎视蛋白基因的cDNA序列1 632 bp,包括一个1 140 bp的完整开放阅读框架,编码379个氨基酸,理论蛋白分子量(Mw)41.50 ku,等电点(pI)7.56。GenBank登录号为JN185654。UV视蛋白包括7个跨膜拓扑结构和一个G蛋白偶联受体家族,第107位赖氨酸与UV视蛋白的紫外敏感性有重要关系。同源性分析显示,小地老虎UV视蛋白基因与其他昆虫的UV视蛋白基因具有较高同源性。本研究对深入探究UV视蛋白在动物夜行生活中的作用具有重要意义。     

赤拟谷盗β1-微管蛋白cDNA基因的克隆及序列分析

本研究利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速扩增cDNA末端（RACE）技术对赤拟谷盗Tribolium costaneum体内β1-微管蛋白（β1-tubulin）基因进行了克隆,获得的基因（EU555191）全长为1573bp,包含1344bp的完整开放阅读框（ORF）。根据该基因推导出447个氨基酸序列,理论分子量约为50KD,等电点为4．68,该序列含有2个氨基酸保守区：NNWAKGHY和RKAFLHWYTGEGMDEMEMEFTE,并且在该基因的5’端启动子调控区发现TATA-box保守基因序列。系统发育关系研究表明：本研究扩增出的基因与其它昆虫β-tubulin基因序列有较高的同源性,达90％左右。     

哈茨木霉β微管蛋白基因的克隆与序列分析

根据哈茨木霉T88菌丝体cDNA文库中的β微管蛋白基因EST序列,采用反向PCR方法以哈茨木霉T88的基因组DNA为模板,扩增得到了1.74kb的β微管蛋白基因编码区、1.5kb的5′非编码区和1.0kb的3′非编码区。哈茨木霉β微管蛋白基因编码446个氨基酸,与其它真菌β微管蛋白基因具有较高的序列同源性。对哈茨木霉β微管蛋白的三维结构进行了同源建模,模建的结果为研究哈茨木霉β微管蛋白自身特性及其与抗微管类杀菌剂的作用机制提供了分子基础。     

大蜡螟中类肽聚糖识别蛋白Gm21的鉴定、基因克隆及序列分析

为了调查毒素蛋白免疫下大蜡螟Galleria mellonella L.产生的免疫相关蛋白,采用双向电泳的方法,从大蜡螟血淋巴中鉴定得到一种昆虫肽聚糖识别蛋白Gm21,通过RT-PCR、cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到其全长基因,该基因全长cDNA具有完整的编码框,编码211个氨基酸,序列分析表明该蛋白是一种具有潜在酰胺酶活性的S型肽聚糖识别蛋白.本研究中Gm21蛋白在免疫压力下的上调表达及其cDNA序列的克隆,对进一步深入研究昆虫肽聚糖识别蛋白的功能具有重要的意义.     

小麦ζ-胡萝卜素脱氢酶cDNA全序列的克隆

目的:从普通小麦品种EM12中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)基因的cDNA全长序列.方法:根据已报道的EST序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,对EST两端未知序列进行扩增、克隆和测序.结果:克隆得到cDNA全长序列2 150bp,其ORF序列为1 707bp,预测编码568个氨基酸残基,推测蛋白质分子量62.5kDa,带有一段19aa的信号肽序列.结论:根据同源序列分析,该序列与水稻ZDS蛋白的同源性为97%,与玉米ZDS蛋白的同源性为91%,而且与其他高等植物的ZDS都具有较高的同源性.该基因序列的分离与克隆为进一步开展小麦β-胡萝卜素生物合成机制的研究和利用转基因技术提高小麦β-胡萝卜素含量的研究奠定了基础.     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

黑曲霉NRRL3135 bgl基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉菌株NRRL3135中扩增了β-葡萄糖苷酶(BGL)基因的全长cDNA序列,被命名为bgl3135(GenBank登录号:FN430671)。对该基因编码的BGL进行了同源性分析并预测了其三维构象。试验结果表明,bgl3135的全长cDNA为2598bp,含有一个2583bp的开放阅读框(ORF),编码一个长度为860个氨基酸残基的蛋白质。同源性分析表明,该基因编码的蛋白与来自黑曲霉As3.350和CBS513.88的BGL(GenBank登录号分别为DQ655704和XM_001398779)的相似性最高,其氨基酸序列同源性分别达99%。参照已发表的β-葡萄糖苷酶(BGL)的氨基酸保守序列,判断本研究所克隆的bgl基因属于糖苷水解酶基因家族3的成员。三维结构预测表明,该BGL的立体构象中存在20个α-螺旋和15个β-折叠,对构成和维持酶的底物识别和催化活性位点可能起着重要作用。     

甜菜夜蛾烟碱型乙酰胆碱受体β1亚基基因的克隆与序列分析

烟碱型乙酰胆碱受体是昆虫体内重要的神经受体,同时也是杀虫剂作用靶标.从甜菜夜蛾Spodoptera exigua3龄幼虫体内提取总的RNA,经过反转录,利用RT-PCR获得了烟碱型乙酰胆碱受体6个α和1个β亚基基因的cD-NA序列片段,并利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了β亚基基因的cDNA序列全长.该基因命名为SenAChRβl,其长度为2231个碱基,含有一个1575个碱基的开放读码框,开放读码框编码524个氨基酸残基,预测的分子量为60 kDa.推导得到的氨基酸序列与其它昆虫特别是鳞翅目昆虫的烟碱型乙酰胆碱受体β亚基具有高度的同源性,并具有典型的烟碱型乙酰胆碱受体β亚基特征化位点.     

棉铃虫围食膜肠粘蛋白基因HM72的克隆、表达及其蛋白组织定位

围食膜是昆虫中肠上皮细胞分泌形成一层特有的非细胞性半透膜, 肠粘蛋白是其重要的组成成分。本研究利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体免疫筛选棉铃虫中肠cDNA表达文库,共获得385个阳性克隆, 经DNA测序和序列对比, 确认其中之一为编码棉铃虫中肠围食膜肠粘蛋白的cDNA克隆HM72。序列分析显示,该cDNA全长为2 888 bp (GenBank登录号： HM017910), 其中ORF长2 469 bp, 编码823个氨基酸, 包含起始密码子ATG和终止密码子TAA,在poly A 末端上游19 bp处有一个多聚腺苷酸信号序列AATTAA。氨基酸序列分析表明, 其N-端含有16个氨基酸的信号肽, 预测分子量为84.2 kDa,等电点3.63,为酸性蛋白质。结构域分析表明,该蛋白具有5个几丁质结合功能域,一个粘蛋白结构域和两个甘氨酸-天冬氨酸富集区,该基因成功表达100 kDa的目的蛋白。Western blot分析表明,HM72蛋白存在于棉铃虫中肠、围食膜、粪便及蜕中,并由整个中肠分泌,而在棉铃虫脂肪体、体壁、马氏管、唾腺、消化液、血淋巴中没有检测到HM72蛋白。本研究为棉铃虫生物防治相关功能基因的深入研究以及完善昆虫围食膜理论等提供了依据。     

小地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及mRNA组织特异性表达

β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本文以小地老虎Agrotis ipsilon Hufngel预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到其β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。该序列含有2701个碱基,包括一个1788个碱基的开放阅读框,编码一个含595个氨基酸的蛋白,分子量约为68.3ku,等电点为5.48。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶高度同源。基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU985280。该基因在小地老虎取食期和预蛹期的马氏管、中肠、脂肪体、体壁和去中肠虫体中均含有mRNA水平的表达。     

小菜蛾乙酰胆碱酯酶cDNA片段的克隆和序列分析

利用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)的方法对小菜蛾Plutella xylostella的乙酰胆碱酯酶基因cDNA片段进行了克隆和序列分析。通过简并性上游引物和下游引物扩增出了小菜蛾乙酰胆碱酯酶基因281bp的cDNA片段。同源性分析表明, 该cDNA片段与其它昆虫乙酰胆碱酯酶基因序列具有较高的同源性。     

千里光β-微管蛋白基因结构与功能的生物信息学分析

β-微管蛋白是影响细胞新陈代谢和行使功能的重要结构物质,研究β-微管蛋白基因的序列信息对揭示其蛋白结构与功能具有重要指导意义。从千里光全长cDNA文库中分离得到β-微管蛋白基因,并采用生物信息学软件进行序列分析。结果显示,该基因长度为1750 bp,编码的蛋白质长度为448个氨基酸,与柚子β-微管蛋白的同源性最高,达96%;其蛋白质分子量为50.01 kD,理论等电点为4.83。β-微管蛋白二级结构主要组成为无规则卷曲结构和α螺旋结构;结构域分析发现该蛋白具有两个保守结构域;三级结构预测为相对稳固的类球形结构;信号肽分析将该蛋白主要定位于细胞质、过氧化物酶体、线粒体基质等亚细胞器位置。将该基因序列上传至GenBank所获得的登录号为KF887495。本实验结果为千里光β-微管蛋白的作用机制揭示和应用研究提供了基础数据,也为植物β-微管蛋白基因的分子研究提供了理论依据及基础资料。     

粘虫β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

β-actin基因作为actin家族的一员,在基因定量实验中常用作内参基因。本实验运用RT-PCR和RACE技术,以粘虫Mythimna separata(Walker)cDNA为模板,对β-actin基因进行克隆获得全长cDNA序列,并利用生物信息学方法,对β-actin基因全长cDNA序列及推测得到的β-actin蛋白序列进行分析。结果表明,获得的粘虫核β-actin基因cDNA序列长度为1 472 bp,其中包括68 bp的5′非编码区、273 bp的3′非编码区和1 131 bp的开放阅读框,编码一个376个氨基酸蛋白,具有actin蛋白家族典型特征。推测得到的粘虫β-actin蛋白理论分子量为41.7497 ku,等电点为5.29,富含6种类型的特定功能位点。该蛋白序列与其他动物β-actin蛋白序列具有97.9%～99.7%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示β-actin在6种不同组织间表达无显著差异(P>0.05),表明β-actin可作为研究粘虫不同基因表达水平高低的可靠内参基因。该基因的cDNA序列已经递交GenBank并获得登录号为GQ856238。     

异色瓢虫过氧化氢酶(Catalase)的基因克隆及序列分析

【目的】克隆异色瓢虫Harmonia axyridis保护酶系中过氧化氢酶(Catalase,CAT)的全长cDNA序列,并分析该基因的基本特性。【方法】采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫中克隆到HaraxCAT基因的cDNA全序列(GenBank登录号KC991026),并采用生物信息学的相关方法进行了分析。【结果】HaraxCAT的cDNA序列全长1 781 bp,其包含110 bp的3′非编码区域和45 bp的5′非编码区域,可读框长1 626 bp,编码541个氨基酸。预测该基因编码蛋白的分子量为61.55 ku,理论等电点为8.33,包含3个糖基化位点,无信号肽序列和跨膜结构。并且该基因包含了一个长达18个氨基酸的潜在的活性位点序列FDRERIPERVVHAKGAGA和血红素配体信号序列RIFSYGDTH。同源比对不同昆虫的CAT蛋白序列,发现昆虫CAT非常保守,HaraxCAT与其他昆虫的同源性高达65%及以上,与赤拟谷盗Tribolium castaneum同源性最高,达75.25%;系统发育分析表明其与鞘翅目赤拟谷盗和白星金花龟Protaetia brevitarsis亲缘关系最近。【结论】获得异色瓢虫catalase基因的cDNA全长序列,证实昆虫CAT蛋白非常保守。     

用Touch-Up PCR克隆中国仓鼠存活蛋白基因及其序列分析

目的:通过Touch-UpPCR(上升PCR)的方法从中国仓鼠卵巢细胞中克隆存活蛋白基因,并对其进行序列分析。方法:分别从293、H22、CHO-S细胞中提取总RNA并反转录得cDNA,然后用Touch-UpPCR克隆存活蛋白基因。结果:获得了存活蛋白基因,全长423bp,序列测定及同源性分析表明其与GenBank中报道的人以及小鼠的存活蛋白基因高度同源,同源性分别为84.8%和88.2%;氨基酸序列分析表明它们的蛋白产物具有功能相同的BIR结构域。结论:从中国仓鼠卵巢细胞中首次克隆到存活蛋白基因。     

猪SOCS-2基因的克隆及序列分析

从中国地方猪品种八眉猪(BaMei)肾脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法克隆了猪SOCS-2(suppressor of cytokinesignaling-2,细胞因子信号转导抑制因子-2)基因的cDNA序列,经T/A克隆,插入到pMD19-T载体上,导入大肠杆菌DH-5α,阳性克隆经PCR鉴定后进行测序,将测序结果与GenBank中已登录的人、大鼠和小鼠SOCS-2基因的序列进行同源性比较,利用生物信息学和分子生物学软件对猪SOCS-2基因编码的蛋白进行结构预测。结果表明:首次成功克隆了猪SOCS-2基因的cDNA序列(GenBank登录号为EF121242),其长度为822bp,该基因ORF区核苷酸序列与其他物种相比同源性达到93%以上,氨基酸同源性则达到89%以上,生物信息学分析表明该蛋白分子量为22.25kD,等电点pI=8.30,包含199个氨基酸残基。该基因cDNA序列的克隆,有利于进一步研究SOCS-2调节机体发育的分子机理。