瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动.本研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0～200 Hz)刺激0～24h后Egr-1基因表达量的变化.结果显示:瘤背石磺Egr-1基因cDNA序列全长2 556bp,含134 bp的5'端非编码区、709 bp的3'端非编码区和1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸.瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有α螺旋和β折叠.瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P＜0.05).相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P＜0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据.     

瘤背石磺Egr-1基因的克隆、分析及低频声音刺激对其表达的影响

早期生长反应因子1(Egr-1)基因又名为Zif268、NGFI-A、Krox-24、Tis8、ZENK,分布于脊椎动物的神经细胞中,参与识别功能相关的神经活动.本研究通过cDNA末端快速扩增法(RACE)获得瘤背石磺(Onchidium reevesii)Egr-1基因全长序列,进行蛋白质特征分析、氨基酸序列预测以及Egr-1基因的组织差异表达,并检测了不同低频声音(0～200 Hz)刺激0～24h后Egr-1基因表达量的变化.结果显示:瘤背石磺Egr-1基因cDNA序列全长2 556bp,含134 bp的5'端非编码区、709 bp的3'端非编码区和1 713 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸.瘤背石磺Egr-1蛋白分子质量为61.31 kD,理论等电点为6.14,平均疏水指数-0.491,不含信号肽;二级结构和三级结构预测显示有α螺旋和β折叠.瘤背石磺Egr-1基因在其腹足、背部皮肤、神经节、肝胰腺、两性腺中均有表达,在神经节和两性腺中高表达,背部皮肤和肝胰腺中组织表达量最低(P＜0.05).相比对照组,受到低频声音刺激0.5 h,后瘤背石磺神经节中Egr-1基因的表达量显著升高,且不同频率声音间表达量差异显著(P＜0.05),推测Egr-1基因参与了瘤背石磺识别低频声音功能相关的神经活动,所得结果为进一步研究瘤背石磺识别处理声音信息的分子机制提供重要的基础数据.     

梨小食心虫几丁质合成酶2基因的克隆与表达研究

【目的】研究梨小食心虫Grapholitha molesta(Busck)几丁质合成酶2(GmCHS2)基因序列和表达特性,为进一步研究其功能及新型杀虫剂的开发提供理论依据。【方法】利用转录组数据和RACE技术首次获得GmCHS2基因cDNA序列(命名为GmCHS2,GenBank登录号为KY242360),利用其他昆虫同源序列构建系统发育树,利用实时荧光定量PCR技术研究GmCHS2在不同发育阶段和不同组织的表达特性。【结果】GmCHS2基因序列全长4991bp,开放阅读框为4554bp,其中5′端非编码区长267bp,3′端非编码区长170bp,共编码1517个氨基酸,包含了14个跨膜螺旋。系统发育树结果表明该基因属于几丁质合成酶2类基因。GmCHS2基因在试虫不同发育阶段都有表达,预蛹期和成虫期表达量最高;不同组织中,前肠和中肠的表达量最高,其次是后肠,其余组织表达量很少或不表达。【结论】本文研究了GmCHS2基因在梨小食心虫不同发育阶段和组织部位的表达特性,该基因可能在梨小食心虫生长发育过程中具有重要作用。     

莲藕CBF2基因cDNA克隆及序列分析

目的:克隆莲藕CBF2基因的c DNA全长并对其进行序列分析。方法:根据已有的ESTs序列,设计3'和5'端RACE引物,运用RACE技术克隆莲藕CBF2基因c DNA全长。结果:克隆得到全长为1 560bp c DNA序列,其中包括350bp的3'非编码区和124bp的5'非编码区及一个1 086 bp的完整开放阅读框,编码362个氨基酸,序列末端有poly(A)尾。其核苷酸序列与NCBI数据库中大豆DREB2C/CBF2、马铃薯DREB2A/CBF2、黄瓜DREB2A/CBF2及花生DREB2A/CBF2的同源性较高,分别为83%、77%、76%和76%,因此把该基因命名为Lr CBF2。氨基酸序列进化树分析表明该基因与葡萄相关基因亲缘关系较近。结论:分离克隆得到莲藕CBF2基因,为进一步研究莲藕中该基因的功能奠定基础。     

牡丹PoSAD基因克隆与表达分析

以凤丹牡丹(Paeonia ostii)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,克隆得到凤丹牡丹硬脂酰-ACP去饱和酶基因SAD的cDNA全长,命名为PoSAD(GenBank登录号为KY038819)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 559bp,其中开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,3′端非编码区长172bp,5′端非编码区长123bp。多序列比对结果表明,凤丹牡丹PoSAD氨基酸序列含有2个保守结构域。系统发育分析结果显示,凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PoSAD蛋白无跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性结果分析表明,PoSAD基因在凤丹牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,且在花瓣中表达量最高,雌蕊中次之,在根中的表达量最低;不同时期种子中,60d表达量最高,80d次之,10d中表达量最低。     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

三疣梭子蟹Δ6脂肪酸去饱和酶基因全长cDNA克隆与组织表达

旨在探讨三疣梭子蟹高度不饱和脂肪酸自身合成能力,探究三疣梭子蟹HUFA生物合成途径。采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到三疣梭子蟹△6去饱和酶cDNA全长序列,并利用荧光定量PCR技术进行肝胰腺、肠道、鳃等8种组织的表达分析。通过分析序列表明,基因序列全长2875bp,其中5'非编码区长465bp,3'非编码区长1078bp,开放阅读框(ORF)长1332bp,编码443个氨基酸;并且编码的蛋白序列具有典型的去饱和酶特性:3个组氨酸保守区,一个N端细胞色素b5结构域以及一个血红素结合的HPGG结构域。荧光定量PCR结果显示,Δ6脂肪酸去饱和酶基因在三疣梭子蟹多个组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次是肠道和肌肉,心脏中表达最少。结果表明三疣梭子蟹具有△6去饱和酶。     

墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RACK基因的克隆与表达分析

RACK基因作为鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基中的部分基因,主要编码一种神经肽信号分子,在膜结合受体和细胞内效应器之间起信号传递作用。为了研究RACK基因在墨吉明对虾各个组织和发育周期中的表达,本实验通过基因克隆技术获得墨吉明对虾RACK基因ORF序列,共957 bp,编码318个氨基酸,并通过荧光定量PCR技术检测RACK基因在墨吉明对虾不同组织的表达量变化。数据分析表明,RACK基因在墨吉明对虾各个部位都有表达,其中在眼柄表达量最高,在胸节神经和血液中表达量次之,在肌肉表达量最低(p0.05)。RACK基因在墨吉明对虾整个生长周期中都有表达,且存在显著差异,总体来看糠虾时期的RACK基因表达量明显高于无节幼体、溞状幼体和仔虾时期(p0.05)。本研究为更加深入研究RACK基因的功能与表达分析提供理论基础。     

棉铃虫保幼激素环氧水解酶基因的克隆及其原核表达

通过兼并引物PCR结合RACE技术,克隆了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)保幼激素环氧水解酶(juven-ile hormone epoxide hydrolase,JHEH)的基因,该基因的开放阅读框为1389 bp,编码463个氨基酸.预测蛋白分子量为52 kD,等电点为6.39.N末端存在由20个氨基酸组成的疏水性信号肽序列,存在组成JHEH催化三联体的氨基酸Asp(227)、Glu(403)和His(430)以及组成阴氧离子洞的氨基酸Tyr(298)、Tyr(373)和HGWP花样结构.其氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫有很高的同源性.在大肠杆菌中表达JHEH基因的编码区,Western blot结果表明,棉铃虫JHEH已被成功表达.利用该基因序列可以在分子水平上研究棉铃虫JHEH基因的时空表达情况,进一步研究保幼激素(juvenile hormone,JH)的代谢途径及其功能.     

珊瑚藻R-藻红蛋白γ亚基基因的克隆

根据珊瑚藻(Corallina afficinalis L.)R-藻红蛋白γ亚基N末端部分氨基酸序列(P83592)设计简并引物,结合RACE方法,扩增获得g亚基的全长cDNA序列.结果表明,序列全长为2 308 bp(AY209894),5'非编码区长1 203bp,3'非编码区长145 bp,编码区长960 bp,编码320个氨基酸组成的前体,包含71个氨基酸构成的信号肽和249个氨基酸组成的成熟蛋白.成熟蛋白序列内部存在重复序列与前人的报道一致.珊瑚藻亚基cDNA序列不同克隆子的测序结果表明,g亚基cDNA序列存在不同的3'末端,说明该基因可能存在多个拷贝或存在转录后加工.此外,扩增获得g亚基DNA序列(AY308999),比较表明编码区内部没有内含子存在.本文是对珊瑚藻R-藻红蛋白g亚基基因序列的首次报道.     

Diacylglycerol kinase δ associates with receptor for activated C kinase 1, RACK1

The δ-isozyme (type II) of diacylglycerol kinase (DGK) is known to positively regulate growth factor receptor signaling. DGKδ, which is distributed to clathrin-coated vesicles, interacts with DGKδ itself, protein kinase C and AP2α. To search for additional DGKδ-interacting proteins, we screened a yeast two-hybrid cDNA library from HepG2 cells using aa 896–1097 of DGKδ as a bait. We identified aa 184–317 (WD40 repeats 5–7) of receptor for activated C kinase 1 (RACK1), which interacts with various important signaling molecules, as a novel binding partner of DGKδ. Co-immunoprecipitation analysis, using COS-7 cells co-expressing RACK1 and DGKδ, revealed that RACK1 selectively interacted with DGKδ, but not with type I DGKs, in mammalian cells. The interaction was dynamically regulated by phorbol ester. Intriguingly, DGKδ appeared to recruit RACK1 to clathrin-coated vesicles and co-localized with RACK1. These results suggest that DGKδ serves as an adaptor protein to regulate the localization of the versatile scaffold protein, RACK1.     

RACK1 regulates integrin-mediated adhesion,protrusion, and chemotactic cell migration via its Src-binding site

Mammalian cDNA expression cloning was used to identify novel regulators of integrin-mediated cell-substratum adhesions. Using a focal adhesion morphology screen, we identified a cDNA with homology to a receptor for activated protein kinase C (RACK1) that induced a loss of central focal adhesions and stress fibers in CHO-K1 cells. The identified cDNA was a C-terminal truncated form of RACK1 that had one of the putative protein kinase C binding sites but lacked the region proposed to bind the beta integrin cytoplasmic domain and the tyrosine kinase Src. To investigate the role of RACK1 during cell spreading and migration, we tagged RACK1, a C-terminal truncated RACK1 and a point mutant that does not bind Src (RACK Y246F) with green fluorescent protein and expressed them in CHO-K1 cells. We found that RACK1 regulates the organization of focal adhesions and that it localizes to a subset of nascent focal complexes in areas of protrusion that contain paxillin but not vinculin. We also found that RACK1 regulates cell protrusion and chemotactic migration through its Src binding site. Together, these findings suggest that RACK1 regulates adhesion, protrusion, and chemotactic migration through its interaction with Src.     

大鳞副泥鳅和泥鳅GNB2L1基因的克隆、表达及系统进化分析

由G蛋白β2亚基类似物1基因(GNB2L1)编码的蛋白激酶C受体(RACK1)是一个高度保守的锚定蛋白,属于WD40结构域蛋白家族成员,在细胞信号转导等生命过程中发挥着重要作用。本文采用RACE技术和基因克隆技术分别对大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)精巢组织的GNB2L1基因c DNA序列进行了克隆。序列分析表明,大鳞副泥鳅GNB2L1基因c DNA序列全长1 115 bp,开放阅读框(ORF)长965 bp,编码317个氨基酸;泥鳅GNB2L1基因c DNA序列的开放阅读框长965 bp,编码317个氨基酸;两种泥鳅GNB2L1基因编码的蛋白与其他鱼类的RACK1蛋白的同源性为94%~97%,且不同进化地位物种的GNB2L1基因均由8个外显子和7个内含子组成。以GNB2L1基因为标记基因,构建的鱼类系统发育树显示,大鳞副泥鳅和泥鳅在进化上的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,GNB2L1基因在大鳞副泥鳅成体各组织中均有表达,且在脑组织的表达量高于其他组织。以上结果表明,GNB2L1基因为一个进化保守基因,可能在大鳞副泥鳅的细胞活动中发挥着重要作用。     

Expression and purification of receptor for activated C-kinase 1 (RACK1)

Receptor for activated C-kinase (RACK1) binds to protein kinase C and functions as an anchor for several other cellular components. Most in vitro studies of RACK1 have been carried out with RACK1 fused to a soluble fusion protein partner, such as GST or MBP. Here, we show that fusion complexes may exist as large soluble aggregates and thereby lead to false conclusions about the biological activity of RACK1. We developed a purification procedure that gave soluble monodisperse molecules of the protein. The RACK1 gene was cloned and expressed in a pMAL vector. After purification of the resulting MBP-RACK1 fusion protein, RACK1 was excised from MBP by thrombin, rendering RACK1 in a soluble monodisperse form as monitored by fluorimetric static light scattering, gel filtration, and ultracentrifugation. Circular dichroism analysis revealed that RACK1 was properly folded with a T(m) of approximately 62 degrees C and contained the predicted portions of secondary structures. The biological activity of the purified protein was verified by binding to activated protein kinase C. The production of soluble, high-purity RACK1 will allow structural studies and functional in vitro studies to identify interacting partners to this important scaffold protein.     

Isolation of Complementary DNAs Coding for a Receptor for Activated C Kinase (RACK) from Zebrafish (Danio rerio) and Tilapia (Oreochromis niloticus): Constitutive Developmental and Tissue Expression

We have cloned and sequenced complementary DNAs coding for a receptor for activated C kinase (RACK) from two species of teleost fishes, zebrafish (Danio rerio) and tilapia (Oreochromis niloticus). The tilapia clone is 1063 nucleotides long, and the zebrafish clone is 1069 nucleotides long. Both clones contain an open reading frame coding for the complete RACK protein of 317 amino acids. Northern hybridization analysis using these clones as probes detected a 1.2-kb band, indicating that these are nearly full-length cDNA clones. In tilapia, RACK messenger RNA was expressed in all tissues examined. In situ hybridization detected the presence of mRNA for this RACK sequence in unfertilized eggs and embryos (development up to 24 hours) from zebrafish. Received July 13, 1998; accepted January 14, 1999     

凡纳滨对虾MT基因序列及其在卵巢发育和低温胁迫中的表达分析

在低温处理仔虾全长cDNA文库的筛选测序中, 获得凡纳滨对虾(Litopenaeus vannmei)金属硫蛋白基因全长cDNA序列, 该序列含有425个碱基, 包含177 bp开放阅读框, 上游98 bp的非编码区及下游150 bp 的非编码区, 编码58个氨基酸, 其中半胱氨酸含量丰富, 富含金属硫蛋白典型的Cys-X(1-3)-Cys 结构。多序列比对表明, 凡纳滨对虾MT蛋白序列与美洲螯龙虾(Homarus americanus)MT蛋白序列具最高同源性72.4%。Real-time PCR结果表明, 凡纳滨对虾MT基因在卵巢组织中呈优势表达, 在不同发育期的卵巢中的表达量都很高, 在低温处理凡纳滨对虾肝胰腺组织中上调表达。实验所得结果为研究凡纳滨对虾金属硫蛋白基因在生殖发育和低温应激中的功能提供了参考。       

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5’非翻译区（5^1UTR）,165bp的3。非翻译区（3’UTR）。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4（GenBank登录号JF268686）。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36．5kDa,等电点为9．01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。