重组含有Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)基因的杆状病毒在昆虫细胞中的表达

用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因３个外显子开放读码框架的长２．３ｋｂ的ｃＤＮＡ片段。用重组病毒感染Ｓｆ９细胞,用免疫荧光染色,结果表明：４８小时表达重组蛋白,７２小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,９６小时后细胞出现破碎。我们采集７２小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被抗ＬＭＰ１的单克隆抗体所识别,测定表达蛋白的分子量为６０ｋＤ。经蛋白含量扫描图分析,采用Ｓｅｐｈａｄｅｘ－７５柱初步纯化表达的ＬＭＰ１蛋白,将后者进行裸鼠体内致瘤实验,未见肿瘤生长。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

转译优化对EPO基因在COS7细胞中表达的影响

利用ＣＯＳ７细胞暂时表达系统,研究转译起始序列对ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达的影响。通过ＤＮＡ重组技术,构建了原ＥＰＯ－ｃＤＮＡ表达载体ｐＣＳＶ－ＥＰＯ（１）,其转译起始序列为５＇ＡＡＴＴＣＡＴＧＧ３＇。同时通过定点突变技术,将起始序列改变成５＇ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ３＇,而构建了另一表达载体ＰＣＳＶ－ＥＰＯ（２）。后经序列分析证明无误后和前均通过ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞上清,测定结果为     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

抗品胚抗原单链抗休基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ,与修饰的家蚕核型多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡ ＳｃＦｖ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫,在两者中均得到了高效表达,产物分子量为２８ｋＤ,前者占细胞总蛋白的６％,后者为０．３ｍｇ／蚕。目的基因在家蚕细胞和     

鼠Ⅰ型可溶性白细胞介素1受体基因在昆虫细胞的克隆和表达

白细胞介素１（ＩＬ－１）是一种重要的细胞因子,具有广泛的生物学活性。它通过与细胞表面的白细胞介素 １受体（ＩＬ－１Ｒ）结合而起作用。以杆状病毒为载体在昆虫细胞中克隆表达了小鼠Ｉ型可溶性白细胞介素１受体（ｓＩＬ－１　ＲＩ）基因。以ＮＩＨ／３Ｔ３细胞ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到小鼠ｓＩＬ－ＩＲＩ的ｃＤＮＡ,克隆至杆状病毒转移载体ｐＡｃＧＰ６７Ｂ,将转移重组质粒与野生病毒ＡＣＮＰＶ ＤＮＡ共转染昆虫细胞Ｓｆ９,经同源重组得到重组杆状病毒ｒＡＣＮＰＶ。应用经纯化的ｒＡｃＮＰＶ感染昆虫细胞Ｓｆ９,表达获得重组的ｓＩＬ－１ＲＩ。经对亲和层析样品的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析和对ＩＬ－１β生物活性阻断作用实验证实,表达产物能够与其配基结合,并且能够分泌至细胞培养上清中。     

大鼠甘氨肽α—羟化单氧酶在昆虫细胞中的活性表达

将编码大鼠甘氨肽α－羟化单氧酶（ＰＨＭ）ｃＤＮＡ基因,插入昆虫杆状病毒转移表达载体ｐＢａｃＰＡＫ８,构建成表达质粒ｐＢａｃＰＨＭ２,与修饰的银纹夜蛾核多角体病毒ＢａｃＰＡＫ６线性化ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ２１,通过同源重组,得到在核多角体蛋白基因启动子控制下的ＰＨＭ基因的重组病毒ＢａｃＰＨＭ。用ＢａｃＰＨＭ感染Ｓｆ２１细胞,无血清培养上清在７２小时后检测到酰胺化酶最高活力;用细胞免疫组化法和免疫     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

PAI—2抑制细胞凋亡依赖其蛋白质结合功能域

将纤深酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３重组,构建真核表达质粒并转染ＨｅＬａ细胞,经Ｇ４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ迷鉴定和ＥＬＩＳＡ检测,筛选出稳定表达ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２Ｑ的阳性细胞株。ＥＬＩＳＡ结果表明ＰＡＩ－２突变蛋白质在转染细胞中的表达量与相应野生型ＰＡＩ－２在阳性细胞克隆中的表达量基本相近,ＰＡＩ－２及其突变体在理     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

人白介素6受体功能区片段在E.coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ和ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右,重组蛋白主要包涵体形     

含有Epstein-Barr病毒膜抗原的重组表达质粒及其基因免疫

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒ（ＥＢ）病毒主要的膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因片段插入ｐＨＤ１０１－３质粒的ＣＭＶ启动子下游,构建了真核表达质粒ｐＨＤ－ｇｐ３５０,并转染２９３细胞进行瞬间表达。用免疫荧光法从细胞膜检测到表达的抗原能与其单克隆抗体发生特异性结合,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法证实,表达的抗原分子量为３５０ｋＤ．用能在真核细胞表达的重组质粒ｐＨＤ－ｇｐ３５０的ＤＮＡ,经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ２Ｂ柱纯化后,注射经普鲁卡因预处理的Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠的四头肌,观察到ＥＢＶ－ＩｇＡ／ＭＡ抗体水平比ＥＢＶ－ＩｇＧ／ＭＡ低,而ＥＢＶ－ＩｇＡ／ＭＡ的持续时间比ＥＢＶ－ＩｇＧ／ＭＡ长。采用表达ＥＢＶＭＡ的质粒ＤＮＡ与ＣＨＯ细胞表达的ＭＡ蛋白免疫小鼠,均获得抗ＥＢＶＭＡ的抗体。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在大肠杆菌内的表达及应用

将从中国丙肝病人血清中扩增克隆的丙型肝炎病毒核心蛋白基因（４０８ｂｐ）酶切处理后插入表达载体ｐＪＬＡ５０２内,获得高表达核心蛋白的重组工程菌。将重组菌经４２℃热诱导５ｈ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,表达的核心蛋白占菌体蛋白总量的２０％。经分子筛和吸附层析纯化后获得的核心蛋白,ＥＬＩＳＡ检测证实有较好的抗原性和特异性。用表达的核心抗原加用表达的ＮＳ＿３抗原（Ｃ＿３３）装配的抗－ＨＣＶ试剂盒,经用标准血清验证及与国外第二代抗－ＨＣＶ试剂盒比较,证实符合丙肝诊断试剂要求。     

c-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用

应用反义技术探讨ｃ－ｆｏｓ基因ＥＴ－１调控肺泡Ⅱ型细胞（ＡＴⅡ）表面活性物质（ＰＳ）合成的胞内信号转导中的作用,结果显示：（１）内皮素－１（ＥＴ－１）可提高ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入。（２）蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激活剂ＰＭＡ可使ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入量增加,ＰＫＣ抑制剂Ｈ７可抑制ＥＴ－１的促ＰＳ合成效应。（３）ＥＴ－１和ＰＭＡ可显著提高Ｆｏｓ蛋白表达量,Ｈ７和ｃ－ｆｏｓ反义寡核苷酸（ＯＤＮ）     

hBMP－2cDNA在COS细胞和小鼠肌肉中的表达

研究了骨形态发生蛋白ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ在ＣＯＳ细胞和小鼠肌肉中的表达的情况,从ｐＳＰＳ６５ＢＭＰ－２质粒中回收ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ,删除５＇端的非翻译序列,插入ｐＳＶＬ载体中,构建了含有ＢＭＰ－２全长编码序列的重组表达质粒ｐＳＶＬＢＭＰ－２。将表达质粒导入ＣＯＳ－７细胞中,细胞ＲＮＡ点杂交结果表明,转染ＢＭＰ－２基因的细胞内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ水平明显升高;细胞培养上清的ＥＬＩＳＡ显示,转染ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ后,细胞分泌产生的ＢＭＰ－２显著增加。小鼠实验发现,在肌肉内用注射法导入ＢＭＰ－２重组质粒后,局部组织内ＢＭＰ－２的ｍＲＮＡ转录水平也明显提高。     

人白介素6受体功能区片段在E．coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ的ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３。重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＬ－６Ｒ的抗原性。     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

大瓶螺凝集素的分离纯化及部分性质研究

大瓶螺蛋白腺经磷酸盐缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ凝胶过滤,可获得在不连续ＰＡＧＥ（ｐＨ４．３和ｐＨ８．９）上显示单一蛋白质染色带的大瓶螺凝集素（ＡＧＬ）。该凝集素对人血红细胞无血型专一性,但对Ａ型血红细胞胞的凝集作用最强。ＡＧＬ的血凝活力可被乳糖或半乳糖所抑制。ＡＧＬ分子中的中性糖含量为０．２４ｍｇ／ｍｇ蛋白质。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测得其亚基分     

r－干扰素对喉癌细胞系HEP－2HLA－DR抗原和增殖细胞核抗原表达的影响

本实验用人重组ｒ－干扰素（ｒｈｕ－ＩＦＮ）作用ＨＥＰ－２细胞后ＨＬＡ－ＤＲ抗原和增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）表达的检测来探讨ｒ－干扰素对ＨＥＰ－２细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原表达诱导作用及体外抗增殖活性。用单克隆抗体ＣＲ３／４３（抗ＨＬＡ－ＤＲ）和Ｋｉ－６７（抗ＰＣＮＡ）。以链霉素一生物素技术（ＬＳＡＢ）检测ＨＥＰ－２细胞ＨＬＡ－ＤＲ抗原和ＰＣＮＡ表达,结果显示：ｒ－ＩＥＮ诱导ＨＬＡ－ＤＲ抗原和抑制ＰＣＮＡ表达其强弱与ｒ－ＩＦＮ剂量有关。资料提示：ｒ－ＩＦＮ不仅对ＨＥＰ－２细胞有细胞毒作用,同时能调节其细胞膜特性,因而在喉癌的治疗中是有效的。