人α型干扰素家族定向进化文库的构建及细胞筛选

Mixtures of twelve human interferon alpha genes were digested randomly with DNase I. DNA fragments of 30～50 bps were reassembled into a full length interferon gene with sexual PCR without primer (DNA Shuffling). This primerless PCR product was further amplified with additional PCR with primers containing restriction enzyme sites. Then these PCR products were cloned into the phagemid expression vector PcantAb5E to form an expression library displaying interferon molecules. Regarding WISH cells as a standard strain rich in IFN receptor complex, we developed a new and feasible panning method with WISH cells and performed a competitive washing selection strategy. Using this method in combination with antiviral activity assay, we got two clones showing higher antiviral activity compared with phage IFN α2b. Sequencing results showed that they are hybrids containing two and four interferon alpha genes. Now we are cloning them into prokaryotic expression vector and want to get purified sample to determine their biological activity and biochemistry characters.     

噬菌体显示技术改造人干扰素α1c/86D的研究

利用噬菌体表面显示技术表达具生物活性的干扰素α1c,并通过构建和筛选突变文库 ,以得到高受体结合能力和高比活性的新α1c干扰素 .利用噬菌粒载体pCANTAB5E表达了人IFNα1c/ 86D基因 ,利用随机 6肽库和干扰素的中和抗体推导干扰素α1c的受体结合区及关键性结合残基 ,运用盒式突变构建了基于AB环的突变库 ,其中氨基酸 2 9,3 1,3 2 ,3 5位完全随机化 ,并直接利用WISH细胞选择出高抗病毒活性的干扰素突变体 .结果获得了 3个重组噬菌体干扰素突变体 ,其抗病毒活性是干扰素母体的 4～ 16倍 .这一结果为国内外首次报道利用噬菌体表面显示技术的筛选表达优势改造干扰素以提高抗病毒活性 ,实验结果说明了其可行性 ,并提示干扰素突变体的比活性有可能较母体高 .     

人干扰素α1b突变体IFNα1b/31K的构建及其生物学评价

目的:构建干扰素α1b突变体IFNα1b/31K,以期获得高效低毒的新型药物分子。方法:根据合理药物设计,采用定点突变技术,将干扰素α1b第31位氨基酸残基突变为K,并构建表达IFNα1b/31K重组蛋白。纯化后,对其抗病毒活性、抗肿瘤细胞增殖活性和动物体内急性毒性进行考察。结果:IFNα1b/31K表达量占菌体总蛋白的30%以上。纯化后的IFNα1b/31K纯度大于95%,比活性约为IFNα1b的1.7倍,抗肿瘤增殖活性比IFNα1b降低,未见对实验动物的急性毒性作用。结论:成功设计构建并表达了高效低毒的IFNα1b突变蛋白分子。     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

C17S和H18D突变对鸡脱辅基细胞色素c跨线粒体膜输入的影响

体外转录鸡脱辅基细胞色素c(apocytochromec,简称apocyt.c)mRNA ,以之翻译apocyt.c并以3 5 S 甲硫氨酸标记 ,在纯化的鸡心线粒体上对它的跨膜转运与其经血红素加合酶催化转化为细胞色素c的关系进行了研究 .结果表明 ,即使在不利于形成细胞色素c的生化条件下鸡apocyt.c也能有效地输入线粒体 .为进一步证实apocyt.c的跨膜转运过程独立于转化为细胞色素c ,对apocyt.c的血红素结合位点进行基因的定点突变 ( 1 7位 :Cys→Ser;1 8位 :His→Asp) ,然后研究了 2个突变体apocyt.c的跨膜转运 .结果C1 7S和H1 8D都仍能有效地输入线粒体 ,但发现转运初速率已显著变慢     

自发性高血压大鼠主动脉α_(1B)及α_(1D)肾上腺素受体第三细胞内环不存在点突变

我们以前的实验显示自发性高血压大鼠（SHR）离体主动脉磷酸肌醇蓄积在无激动剂存在的基础状态下就显著增高。根据G蛋白偶联受体固有活性假说，推测SHR主动脉中介导肌酸磷脂水解的主要受体－α1D和α1B-肾上腺素受体的第三细胞内环可能存在点突变。本实验通过PCR－SSCP鉴定，表明上述突变并不存在。从而提示SHR主动脉磷酸肌醇蓄积基础水平增加并非因α1D和α1B-肾上腺素受体第三细胞内环区域突变所引起的受体固有活性所致。     

INTU-siRNA质粒的构建及在人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞中的筛选

目的：构建人源靶向特异INTU-si RNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型。方法：构建四对人源INTU序列（编号分别为INTU-29、INTU-31、INTU-33、INTU-35）si RNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-si RNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24 h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒。结果：空载体和INTU-si RNA质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-si RNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-si RNA组的荧光强度均显著高于正常组（P<0.01）,提示质粒均转染成功。荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组...     

重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肺组织病理学的影响

目的:研究重组人干扰素α1b对呼吸道合胞病毒感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肺组织病理学的影响.方法:将40只BALB/c小鼠随机分为5组,分别为正常对照组、感染模型组、重组人干扰素α1b 3.125 μg剂量组、重组人干扰素α1b 12.5 μg剂量组和重组人干扰素α1b 50 μg剂量组.建立感染小鼠模型成功后,连续雾化干预5天,第6天摘眼球取血、肝素化处理,流式细胞术检测小鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+水平.剖取小鼠左肺立即固定于10％中性福尔马林溶液24小时,石蜡包埋、切片行HE染色,光镜下观察小鼠肺组织病理学改变.结果:与正常对照组比较,其余各组小鼠外周血CD3+CD8+水平均显著降低,CD3+CD4+与CD3+CD4+/CD3+CD8+水平均显著升高,除重组人干扰素α1b 50 μg剂量组CD3+CD4+水平外,其余各组差异均有统计学意义(P＜0.05);与感染模型组比较,其余各组小鼠外周血CD3+CD8+水平均显著升高,CD3+CD4+与CD3+CD4+/CD3+CD8+水平均显著降低,除重组人干扰素α1b 3.125 μg剂量组CD3+CD8+水平外,其余各组差异均有统计学意义(P＜0.05);重组人干扰素α1b 3.125 μg、12.5μg、50μg剂量组间比较可见,随着药物剂量的成倍增加,CD3+CD8+水平呈递增趋势,CD3+CD4+与CD3+CD4+/CD3+CD8+水平呈递减趋势,除重组人干扰素α1b 3.125 μg与12.5 μg剂量组间P＞0.05,其余各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).肺组织病理学观察到感染模型组小鼠肺组织炎性损伤显著,雾化吸入重组人干扰素α1b后,肺组织炎性损伤程度显著降低.结论:重组人干扰素α1b对RSV感染小鼠外周血T淋巴细胞亚群及肺组织病理学影响显著,具有良好的抗病毒及免疫调节作用,并在一定范围内存在剂量-效应关系.     

环六亚甲基双乙酰胺对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化及PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化

用HMBA作为诱导分化剂.研究了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化效应,并采用免疫荧光技术观察了PKA-RⅡ与PKC-α亚型在细胞内分布的变化.细胞经5mmol/L HMBA处理后,细胞形态产生明显变化.细长突起明显增加,生长速度减慢,倍增时间延长.24小时,48小时,72小时的生长抑制率分别为20%.40.6%.54.8%.细胞在软琼脂上生长不成集落.细胞周期时相的分布发生变化、G_0+G_1期比对照组增加18.4%.而s期细胞比对照组减少14.8%.细胞内cAMP、DG水平也发生了显著变化.HMBA处理24小时后.细胞内cAMP水平上升62%.DG水平下降64.7.处理48小时后.cAMP水平上升76.2%.而DG水平下降的69.8%.以上结果充分表明了HMBA对人胃癌MGc80-3细胞的诱导分化作用.实验中还发现细胞经HMBA处理后.PKC-α分布于胞质,而PKA-RⅡ向胞核移位.提示HMBA对细胞的诱导分化作用与信号传递通路密切相关.     

玉屏风颗粒联合重组人干扰素α-1b雾化吸入治疗对反复呼吸道感染患儿炎性因子和T细胞亚群的影响

目的:探讨在重组人干扰素α-1b雾化吸入治疗的基础上加用玉屏风颗粒对反复呼吸道感染(RRTI)患儿炎性因子和T细胞亚群的影响。方法:将我院于2018年3月~2020年2月期间收治的RRTI患儿180例根据信封抽签法分为对照组(n=90)和实验组(n=90),均给予止咳、退热、平喘、抗感染等常规治疗的基础上,对照组患儿予以重组人干扰素α-1b雾化吸入治疗,实验组患儿则在对照组的基础上联合玉屏风颗粒治疗,比较两组患儿疗效、症状消失时间、炎性因子、T细胞亚群和不良反应。结果:实验组治疗3周后的临床总有效率为91.11%(82/90)高于对照组的78.89%(71/90)(P<0.05)。实验组肺部啰音、发热、喘息、咳嗽症状消失时间较对照组短(P<0.05)。两组治疗3周后血清白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)水平均下降,且实验组低于对照组(P<0.05)。两组治疗3周后CD8⁺较治疗前降低,且实验组低于对照组(P<0.05);CD4⁺/CD8⁺、CD3⁺、CD4⁺均较治疗前升高,且实验组高于对照组(P<0.05)。比较两组不良反应发生率未见统计学差异(P>0.05)。结论:玉屏风颗粒联合重组人干扰素α-1b雾化吸入治疗RRTI患儿,可迅速改善患儿临床症状、T细胞亚群以及炎性因子水平,且不增加不良反应发生率,疗效令人满意。