粘虫核型多角体病毒多角体蛋白基因结构和序列的研究

测定了粘虫核型多角体病毒（Ｌｅｕｃａｎｉａｓｅｐａｒａｔａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＬｓＮＰＶ）两个ＥｃｏＲＶ片段的共１２０１ｂｐ序列,发现了一个７１４ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ）,根据其与多种ＮＰＶ多角体蛋白基因（ｏｃｕ）同源性的比较和５＇端典型的１４ｂｐ保守序列,说明此ＯＲＦ即为ＬｓＮＰＶ的ｏｃｕ基因。根据核苷酸序列预测的多角体蛋白有２４６个氨基酸,其中酸性和碱性氨基酸数相等,疏水氨基酸含量很高,氨基酸组成中以谷氨酸（Ｇｌｕ）含量最高,谷氨酰胺和半胱氨酸含量最低。编码区碱基同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．０％;氨基酸同源性与ＭｂＮＰＶ最高,为９７．５％。密码子偏爱选用以第三个碱基为嘧啶的密码子。二级结构分析表明,α－螺旋（Ｈ）和β－折叠（Ｓ）相等,β－转角含量是Ｈ和Ｓ含量之和。     

粘虫核型多角体病毒一个新基因的序列和结构研究

本文报道ＴｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ的５．５ｋｂ片段的克隆及其物理图谱。测定了其中一个８１９ｂＰ片段的全序列。在长３４６ｂｐ的完整ＯＲＦ的５’端除有ＴＡＴＡｂｏｘ和ＣＡＡＴｂｏｘ以外,还发现有典型的早期基因启动子元件ＡＣＧＴ和ＧＣ单元以及晚期基因的转录起始保守序列ＴＴＡＡＧ。预测的ＯＲＦ产物为１１４个氨基酸、分子量为１３ｋＤ的蛋白质,故命名为ｐ１３蛋白。在ｐ１３基因的Ｃ端和Ｎ端分别有一个亮氨酸拉链和两个类亮氨酸拉链结构（我们称为亮氨酸转型结构和ＬＶＴ重复结构〕．从终止密码起有一个双发卡环结构,ｐ１３基因的５’端调控单元及其排列与ＢｍＮＰＶ和ＡｃＮＰＶ的细胞序死抑制基因（ｐ３５）十分相似,但ｐ１３基因与已经发现的杆状病毒基因序列和氨基酸序列没有同源性．因此,这是一个新的早晚期基因,其调控元件可能具有重要功能。     

大尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白基因的结构分析

大尺蠖核型多角体病毒(BsNPV)的多角体蛋白基因(ocu)定位在2．3kb的BamHl—H片段上,用xho1、sma1、HindIII和PstI构建了H片段的物理图谱,并测定了两端636bp序列。在5’端发现了杆状病毒ocu基因共有的典型特征,即：ATG起始区;启动子区(14bp保守序列);TATA box和CATA box区等。单一xhoI位点在ATG上游-15bp处,适于作为构建ocu基因转移载体的插入位点。在这一基因5’端序列中发现了五个反转重复单元CGAGC GCTCG,讨论了这一单元在杆状病毒ocu基因高效表达中的调控功能。     

粘虫核型多角体病毒和颗粒体病毒侵染粘虫前胸腺的病理观察

观察比较了粘虫核型多角体病毒(Pseudelatia separata NPV,PsNPV)、粘虫颗粒体病毒(Pseudelatia separata GV,PsGV)感染粘虫,以及两种病毒混合感染粘虫后,粘虫(Pseudelatia separata)前胸腺的形态特征和前胸腺细胞的超微结构。结果表明,不同感染组粘虫前胸腺腺体都有不同程度的组织病变,PsNPV感染组在感染晚期与前胸腺相连的气管严重病变,出现大量白色颗粒状物累积,被伊红染成紫黑色,腺体细胞被挤压变形;PsGV感染组的前胸腺腺体变小,单个细胞也小,细胞界限不十分明显;两种病毒混合感染组的腺体细胞小,能被伊红染色的细胞极少。同时,前胸腺细胞的超微结构也有不同程度的病变。     

粘虫核型多角体病毒和颗粒体病毒侵染粘虫前胸腺的病理观察

观察比较了粘虫核型多角体病毒(Pseudelatia separata NPV,PsNPV)、粘虫颗粒体病毒(Pseudelatia separataGV,PsGV)感染粘虫,以及两种病毒混合感染粘虫后,粘虫(Pseudelatia separata)前胸腺的形态特征和前胸腺细胞的超微结构.结果表明,不同感染组粘虫前胸腺腺体都有不同程度的组织病变,PsNPV感染组在感染晚期与前胸腺相连的气管严重病变,出现大量白色颗粒状物累积,被伊红染成紫黑色,腺体细胞被挤压变形;PsGV感染组的前胸腺腺体变小,单个细胞也小,细胞界限不十分明显;两种病毒混合感染组的腺体细胞小,能被伊红染色的细胞极少.同时,前胸腺细胞的超微结构也有不同程度的病变.     

舞毒蛾核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆、测序和表达

从东北林业大学实验林场采集并纯化了舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV-NEFU)。用蛋白酶K消化,提取了病毒基因组DNA。用PCR方法,克隆出了该病毒的多角体蛋白（polyhedrin)基因,并对该基因进行了序列测定。结果显示,该基因序列是一个含有735个碱基对的开放阅读框（ORF）,该阅读框编码245个氨基酸。有5对碱基与加拿大病毒株LdMNPV-G的多角体蛋白基因序列存在差异。LdMNPV-NEFU分离株的多角体蛋白基因的第54,109,379,508和701位（从起始密码子中的A开始）分别是C,G,T,C和G,而LdMNPV-G分离株的多角体蛋白基因（ORF）相应位置上的碱基分别是G,C,C,T和T,两个ORF编码的对应位置的氨基酸绝大多数相同,只有一对不同,即由LdMNPV-NEFU编码的天冬氨酸和由LdMNPV-G编码的对应位置的组氨酸。以质粒pT-7-7为载体,多角体蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行了原核表达。     

茶毛虫核型多角体病毒（EpNPV）多角体蛋白基因的定位及克隆

茶毛虫核型多角体病毒 (Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓｐｓｅｕｄｏｃｏｎｓｐｅｒ ｓａＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ简称ＥｐＭＰＶ) ,属于杆状病毒科核型多角体病毒属 ,能使茶毛虫染病死亡。ＥｐＮＰＶ据报道最初由日本学者于 195 7年发现[1] ,随后在其它国家和地区也有相关报道[2 ] ;我国在贵州、湖北、广西和云南等地也有发现 ,并在ＥｐＮＰＶ病毒杀虫剂的大田应用方面做了大量的工作 ,取得了一定的社会、经济和生态效益[3] 。本文以苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(ＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａＭＮＰＶ…     

中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体蛋白基因的序列分析

以AcMNPV的多角体蛋白基因为探针,定位了中国棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HaSNPV）的多用体蛋白基因。序列测定表明,HaSNPV的多角体蛋白基因编码区为738个核苷酸,编码246个氨基酸,预计蛋白质分子量为29kDa。同源性分析表明,HaSNPV与美洲棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HzSNPV）具有最高的同源性,在整个阅读框架中只有4个碱基的差异,其中第179位碱基的变化导致唯一的氨基酸变化,这种变化并未导致其二级结构的改变。此外,两种病毒该基因的启动子结构也完全一样。HaSNPV与其它的SNPV和MNPV的同源性明显要低。结果预示HaSNPV与HzSNPV可能为同种病毒的不同变种。     

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodoptera litura培养细胞,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的3株斜纹夜蛾核型多角体病毒(SpltMNPV)（K-3、G1-2和G10-3）进行了生物学活性和分子生物学的初步研究,克隆了多角体蛋白基因,并进行了序列分析和比较。结果表明:（1）SpltMNPV日本分离株K-3、G1-2和G10-3分别具有不同的特征性酶切图谱,分别属于3种基因型（A型、B型和C型）; （2）3个分离株的芽生型病毒（budded virus）产生能力和多角体产生能力有差异,免疫印迹分析表明,多角体蛋白的分子量也不同;（3）日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由747个核苷酸编码序列（编码249个氨基酸）组成,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为98.9%,与其他6种核型多角体病毒有较高的同源性（61.7%～74.2%）,但其5′端侧翼序列(nt-1～-100)与AcMNPV和BmNPV相比差异显著,在对该基因表达调控起决定性作用的8个高度保守核苷酸序列中（nt-44～-51）有2处发生自然突变。     

茶毛虫核型多角体病毒(EpNPV)多角体蛋白基因的定位及克隆

茶毛虫核型多角体病毒(Euproctis pseudoconspersa Nuclear Polyhedrosis Virus简称EpMPV),属于杆状病毒科核型多角体病毒属,能使茶毛虫染病死亡.EpNPV据报道最初由日本学者于1957年发现[1],随后在其它国家和地区也有相关报道[2];我国在贵州、湖北、广西和云南等地也有发现,并在EpNPV病毒杀虫剂的大田应用方面做了大量的工作,取得了一定的社会、经济和生态效益[3].     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

粘虫核型多角体病毒919bp片段的PCR双链直接序列测定

本文发展了ＰＣＲ克隆和亚克隆技术制备ＤＮＡ测序模板。首先,我们用ｐＵＣ／Ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ＰＣＲ扩增出质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ ＤＮＡ的多克隆位点及其侧冀序列,用ＥｃｏＲＶ和ＸｈｏＩ消化成为左右两个引物多克隆臂,与粘虫核多角体病毒（ＬｓＮＰＶ）的ＥｏｏＲＶ和ＸｈｏＩ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接,经ＰＣＲ扩增,得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板,用ｄｄＮＴＰ链终点     

粘虫核型多角体病毒包涵体蛋白的性质及其对几种肿瘤细胞生长的抑…

ＳＤＳ－ＰＡＧ电泳分析表明粘虫核型多角体病毒的包涵体蛋白由几种多肽组成,其中分子量为３２ｋＤ的主带为多角体的主要结构多钛,经Ｓｅｐｈａｃｅｙｌ Ｓ－２０柱层析纯化后分析了其氨基酸组成,证明此包涵全蛋白是一种疏水氨基酸为主要组成的特异性蛋白。我们发现３２ｋＤ蛋白对Ｈｅｌａ,ＨＬＡＭＰ、ＨＩＣＡＭ等三种肿瘤细胞的生长有不同程序的抑制,用＾３Ｈ－ＴｄＲ标记核酸合成代谢的Ｈｅｌａ细胞的放射活性证实了这种观     

茶尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白单克隆抗体的制备

为了建立一种基于免疫反应检测茶尺蠖核型多角体病毒的方法,以纯化后的茶尺蠖核型多角体病毒作为抗原,免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经间接ELISA筛选及克隆得到了一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为7D3。同时克隆并在大肠杆菌中表达了EoNPV多角体蛋白基因,获得重组多角体蛋白。经Western blotting鉴定,该抗体可与EoNPV的多角体蛋白特异性结合。利用制备EoNPV多角体蛋白的单克隆抗体,建立了间接ELISA测定EoNPV的方法。     

蓖麻蚕核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

蓖麻蚕(Attacus ricini)是我国特有蚕种,以其核多角体病毒(ArNPV)为载体有可能发展成为新的基因工程表达系统,我们建立了ArNPV基因库,并亚克隆了含多角体蛋白(Ph)基因DNA片段。对该1.1kb全长DNA片段进行序列分析,确定ArNPV Ph结构基因全长735bp,与苜蓿尺蠖NPV(AcNPV)、家蚕NPV(BmNPV)同源性分别为76%和81%,ArNPV 5'端调控结构Rohrmann box与各类NPV的Ph基因相似,但3'下游序列几无同源,显示了ArNPV Ph基因结构的特征性。同时,我们还对Ph基因启动子的其它结构特点作了剖析。     

油桐尺蠖核型多角体病毒多角体蛋白的理化性质及二级结构预测

由ＳＤＳ及梯度胶电泳测得测得油桐尺蠖核型多型多角体病毒多角体蛋白天然状态及亚基分子量分别为３６３ｋＤ与３１．５ｋＤ从而推断此蛋白为十二聚体,亚基间无二硫键作用,ＢｓＮＰＶ多角体蛋白的远紫外圆二色谱显示,它的二级结构含有３１．７％的α螺旋,２３．８％的β折叠及４４．５％的无规卷曲,与二级结构预测结果相符,通过荧光光谱实验推知,ＢｓＮＰＶ多角体蛋白的表面疏水性弱;其色氨酸残基位于蛋白疏水核内部。     

柞蚕核型多角体病毒多角体蛋白基因上游5''''端核苷酸序列分析

核型多角体病毒(Nuclear Polyhedrosis Virus,简称NPV)的核多角体蛋白(Polyhedrin)基因具有一个非常强的启动子和基因调控序列。目前利用这一基因的上述序列已组建了多种表达载体,高效地表达了十几种外源基因产物,成为当前最有前途的新的表达系统。但是,在组建这一病毒载体过程中,为了使插入的外源基因靠近病毒启动子序列,各