戊型肝炎病毒(HEV)合成肽及基因重组抗原免疫反应性研究

用ＯＲＦ２、ＯＲＦ３合成肽抗原（１～１０号）及基因工程重组的ＯＲＦ２抗原（１和２号）分别建立了酶联免疫方法（ＥＩＡ）,检测６０份戊型肝炎病人血清中ＨＥＶＩｇＧ及ＩｇＭ１０个合成肽抗原（Ｓｐ１－Ｓｐ１０）及２个重组抗原（Ｒｅ１、Ｒｅ２）,均和ＨＥＶ阳性血清发生特异反应,但阳性率和反应强度差别很大。以Ｒｅ１（ＯＲＦ２,４０２～６６０）检测的抗体阳性率最高,为９６．７％（５８／６０）;Ｓｐ６（ＯＲＦ３,８８～１２３）次之,为９３．３％（５６／６０）;以上两种抗原混合使用阳性率为１００％（６０／６０）。Ｓｐ６、Ｒｅ１及这两种抗原混合使用检测抗ＨＥＶＩｇＭ,阳性率分别为１８．３％（１１／６０）、６６．７％（４０／６０）和６６．７％（４０／６０）。研究结果表明：合成肽６号（Ｓｐ６）及重组抗原１号（Ｒｅ１）是制备戊肝抗体诊断试剂的理想抗原。     

新型戊型肝炎诊断试剂盒的研制及其应用

用ＨＥＶＯＲＦ３合成肽及ＯＲＦ２重组抗原研制成新型ＨＥＶＥＩＡ诊断试剂盒。与ＧｅｎｌａｂｓＨＥＶＥＩＡ检测比较,灵敏度和特异性均达１００％（６０／６０）。三批试剂精密性测定均＜１０％。该试剂盒置４℃８个月或３７℃４ｄ保持稳定。检测不同肝炎患者ＨＥＶ抗体,发现急性非甲非乙非丙肝炎中有６３．２％,甲肝有１３．４％,乙肝有８．３％,丙肝有６．６％,正常人群为２．９％。所研制的戊型肝炎诊断试剂盒,灵敏度高,特异性强,精密性好,稳定性合格。适用于戊型肝炎诊断及戊肝病毒感染的流行病学调查     

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原多肽检测丁肝病毒IgM抗体及其初步应用

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原（ＨＤＶ－Ａｇ）肽建立了检测抗ＨＤＶ－ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ方法,本法操作简便、快速,重复性好,特异性强,与抗ＨＡＶ－ＩｇＭ、抗Ｈｋ－ＩｇＭ、抗ＨＢｓ－ＩｇＭ、抗ＨＣＶ－ＩｇＩ、抗ＣＭＶ－ＩｇＭ、抗ＲＶ－ＩｇＭ、类风湿因子（ＲＦ）及抗核抗体（ＡＮＡ）阳性血清均不起反应,且可被２－巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,３１例正常人血清抗ＨＤＶ－ＩｇＭ全部阴性,２８例慢活肝患者检出率为３２．１％（９／２８）,１７例慢迁肝患者血清阳性率为１１．８％（２／１７）１８例肝癌和肝硬化病人血清阳性率为２２．２％（４／１８）这三组病人与正常对照者相比较均有显著性差异（Ｐ＜０．００１）。此外,抗ＨＤＶ－ＩｇＭ阳性血清的ＡＬＴ值均明显高于正常参考范围,提示在ＨＤＶ感染过程中,患者肝细胞进一步受损。实验结果证明,抗ＨＤＶ－ＩｇＭ是诊断ＨＤＶ感染的重要指标,对ＨＤＶ感染早期诊断具有重要价值。     

以合成多肽为抗原的戊肝抗体检测试剂的研制

用戊肝病毒（ＨＥＶ）基因组编码氨基酸序列１－９０１－９１４／２－５１５－５３０、３－９１－１２３、２－６１３－６５４相应的三段合成多肽为抗原、研制出一种检测抗－ＨＥＶＩｇＧ的ＥＬＩＳＡ试剂。以该试剂检测中国、缅甸、印度和前苏联肠道传播非乙型肝炎（ＥＴ－ＮＡＮＢＨ）病人血清１０５份,仅３份中国病人血清阴性,阳性率为９７．１％;检查实验感染ＨＥＶＬ赤猩猩血清,感染前阴性,感染后阳性;检查正常人血清９９     

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原多肽检测丁肝病毒IgM抗全及其初步应用

用人工合成的丁型肝炎病毒抗原（ＨＤＶ－Ａｇ）肽建立了检测抗ＨＤＶ－ＩｇＭ抗体的ＥＬＩＳＡ方法。本法操作简便、快速、重复性好、特异性强,与抗ＨＡＶ－ＩｇＭ＇抗ＨＢｃ－ＩｇＭ、抗ＨＢｓ－ＩｇＭ、抗ＨＣＶ－ＩｇＭ、抗ＣＭＶ－ＩｇＭ、抗ＲＶ－ＩｇＭ、类风湿因子（ＲＦ）及抗核抗体（ＡＮＡ）阳性血清均不起反应,且可被２－巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,３１例正常人血清抗ＨＤＶ－ＩｇＭ全部阴性,２８例慢     

戊肝病毒活性肽的选择,合成与应用

对戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）编码蛋白序列进行了亲水性分析及二级结构预测,选择亲水性强、具有β－转角与β－折叠的区段,采用多肽固相合成法合成了ＨＥＶ基因组３个开读框架（ＯＲＦ１,ＯＲＦ２和ＯＲＦ３）中可能的抗原表位,以免疫学方法进行鉴定并选出了分别来自ＨＥＶ３个ＯＲＦ的、具有重要生物活性与应用前景的３段肽（ＥＨ１７４、ＥＨ２６５、ＥＨ３６２）。在此基础上,进行了抗ＨＥＶＥＬＩＳＡ新型检测试剂盒的实验室研究及临床试用。结果表明,所研究的戊肝抗体检测试剂盒特异性高、临床符合性好、具有可重复性,在戊肝辅助诊断及流行病学调查中具有重要意义。     

戊型肝炎病人血清抗—HEV IgG与IgM和HEV RNA的动态变化

利用酶联免疫试验（ＥＩＡ）及逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,检测了２１０份急性非甲非乙非丙肝炎患者血清和４０例戊型肝炎（戊肝）病人系列血清。在急性非甲非乙非丙肝炎血清中,抗－ＨＥＶ ＩｇＧ、抗－ＨＥＶ ＩｇＭ和ＨＥＶ ＲＮＡ阳性率分别为６２．８６％、４５．２３％和４０．４８％。在戊肝系列血清检测中,抗－ＨＥＶ ＩｇＧ阳性率发病１个月内为９２．５％,发病２￣６个月１００％,１２个月９４．７％,     

抗丙肝病毒核心抗原单克隆抗体的研制与初步鉴定

用基因工程重组技术获得的丙肝病毒（ＨＣＶ）核心蛋白抗原与鼠血清白蛋白交联后免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术成功地建立了４株稳定分泌抗核心抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞,试验结果表明,该４株ＭｃＡｂｓ与免疫抗原及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶ ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５无反应,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。４株ＭｃＡｂｓ中３株为ＩｇＧ２     

血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区基因的克隆及其在中国仓？…

朋原代培养的人脐静脉血管内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取细胞总ＲＮＡ,采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到ＶＥＧＦ受体Ｆｌｔ－１胞外区前３个ＩｇＧ样区域ｃＤＮＡ片段（Ｆｌｔ－１ｎ３）。将获得的受体基因克隆到真核表达载体ｐｃＤ－ＮＡ３．１中,得到重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１／Ｆｌｔ－１ｎ３,通过南体转染方法将其转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）,用Ｇ４１８筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞砍隆。经固相结合实验筛选     

以人工合成多肽为抗原的戊型肝炎病毒抗体检测方法的建立和评价

酶联法是ＨＥＶ感染的主要检测方法,多采用基因表达产物为抗原。近来由于人工合成多肽抗原克服了基因重组抗原制备复杂、非特异结构多、难以纯化的缺点,已广泛用于多种病毒感染的检测。根据已发表的ＨＥＶ氨基酸序列的保守性及亲水性等特点,设计合成了两个多肽ＥＳＰ１和ＥＳＰ２,分别位于ＯＲＦ２和ＯＲＦ３区,以此为混合抗原建立了检测ＨＥＶ抗体的间接ＥＬＬＳＡ法,与市售优质试剂比较,其阳性符合率为９７．７５％,阴性符合率为９９．４３％,总符合率为９８．８６％。该方法灵敏度高、特异性强、安全快速,是检测ＨＥＶ感染和流行病学调查的理想方法。     

传染性法氏囊病病毒中国强毒株A节段cDNA基因的克隆和序列分析

以来自哈尔滨传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ） 强毒株（Ｈａｒｂｉｎ 毒株,Ｈ） 的基因组ＲＮＡ为模板,用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ ＰＣＲ） 的方法得到了其Ａ 节段的全长ｃＤＮＡ 片段,分５＇端（１ ６５９ｂｐ） 和３＇端（１ ４４４ｂｐ） 上下两段分别克隆到ｐＧＥＭＢ○Ｒ － Ｔ 载体上,测定了其核苷酸顺序,在长为３ １０１ ｂｐ 中含有两个阅读框ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ ,分别编码１ ０１２ 个氨基酸的前体蛋白（ＶＰ２ － ４ －３） 和１４５ 个氨基酸的ＶＰ５,ＯＲＦＡ１ 和ＯＲＦＡ２ 有部分的重叠。将核苷酸序列及推测出的氨基酸序列与已报道的ＩＢＤＶ 血清Ⅰ型和Ⅱ型毒株的相应序列进行了比较,结果表明：Ｈ 毒株与其它血清Ⅰ型毒株之间,在核苷酸水平上存在２５ｂｐ － ２６７ｂｐ 的差异;在氨基酸水平上存在１７ ～４０ 个氨基酸的差异。在ＶＰ２ － ４ － ３ 内比较显示,Ｈ 毒株与Ｐ２ 、Ｃｕ－ １ 之间氨基酸的差异最小为１ ．７％ ,Ｈ 毒株与ＵＫ６６１ 之间氨基酸的差异最大为３ ．９ ％ 。变异主要发生在ＶＰ２ 的可变区（２０６ － ３５０ 位氨基酸） ,在Ｈ 毒株所特有的１２ 个氨基酸当中,该区就占５ 个,代表１ ．７６ ％ 的变异。ＶＰ４、ＶＰ３ 和ＶＰ５区各有     

Epstein—Barr病毒BCRF1基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

应用基因重组技术,把编码ＥＢ病毒早期蛋白的ＢＣＲＦ１基因重组于真核表达载体ｐＳＧ５中,并使该基因在乳地鼠肾（ＢＨＫ）传代细胞中获得良好表达,表达率为０．５％。血清学实验证实,鼻咽癌、类风湿性关节炎病人和正常人血清中均不同程度地含有ＩｇＧ／ＢＣＲＦ１抗体,抗体阳性率分别为９２％、８６％和７７％,几何平均滴度（ＧＭＴ）分别是１：１６．３５、１：１４．７２和１：１０．１５。两组病人和正常人血清中ＩｇＡ／ＢＣＲＦ１抗体阳性率和滴度之间有较大差别,它们的阳性率分别是７４％、７１％和１２％,ＧＭＴ分别是１：１２．３２,１：１０．５６和１：２．３５。还证实,鼻咽癌和类风湿性关节炎病人血清中ＩｇＡ／ＢＣＲＦ１和ＩｇＡ／ＥＡ（早期抗原）抗体阳性率和滴度间有很好的相关性,此为首次报导。重组表达质粒ｐＳＧ５－ＢＣＲＦ１的构建和表达为进一步研究ＢＣＲＦ１基因在病毒感染和肿瘤免疫中的作用创造了条件。本文就质粒的构建和３组血清中ＩｇＡ／ＢＣＲＦ１、ＩｇＡ／ＢＣＲＦ１、ＩｇＡ／ＥＡ和ＩｇＧ／ＢＣＲＦ１抗体间的关系和有关问题进行了讨论。     

新型HCV EIA诊断试剂盒的研制

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组结构区核壳蛋白（Ｃ）区抗原、膜蛋白Ｅ１和Ｅ２区抗原,以及非结构区ＮＳ３－ＮＳ５区抗原的区段,已经在原核细胞中获得有效的表达。同时,相应区段中的优势抗原表位肽也经化学合成法大规模地制备。ＨＣＶ基因组上各区段抗原性的分析发现,由Ｃ区和ＮＳ３区分别编码的Ｃ抗原和Ｃ３３ｃ抗原是ＨＣＶ基因组上两个优势抗原区段。其相应的抗体出现早（感染后６周可检出抗Ｃ３３ｃ抗体）,阳转率高（约９９％阳性检出率）,特异性和重复性均优于其它区段抗原。以中国人ＨＣＶ的Ｃ３３ｃ重组蛋白和分支状合成肽ＭＡＰ－Ｃ－１９为复合抗原,研制了适合我国抗ＨＣＶ抗体检测的新型丙型肝炎病毒酶免疫测定（ＨＣＶＥＬＡ）诊断试剂盒。它同当代美国Ａｂｂｏｔｔ／ＵＢＩＨＣＶＥＬＡ诊断试剂的符合率约９８％,同加拿大ＹＥＳ公司ＨＣＶＥＩＡ诊断试剂的符合率约９７．８％,阳性检出率提高了约２％,３次重复性达１００％,表明其特异性、敏感性和重复性均达到了当代第二代ＪＣＶＥＬＡ诊断试剂的水平。我国人群中抗ＨＣＶ抗体的分布情况为：正常人群的检出率１％－２％;外科类住院病人检出率约２８．８％;肝炎患者抗ＨＣＶ阳性率为３４．４％,慢活肝、肝硬化和重症肝炎患者     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列,设计一　对引物,应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体,筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２,并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％,与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切,回收ＯＲＦ２基因,转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间,构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。     

免疫印迹法在实验大鼠汉坦病毒监测中的应用及与间接免疫荧光法之比较

用汉坦病毒汉滩株（７６－１１８）重组核蛋白作为免疫印迹法（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ以下简称ＷＢ）的诊断抗原,用于实验感染大鼠血清抗体效价测定。同时与用汉城株（ＳＲ－１１）感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作抗原的间接免疫荧光法（以下简称ＩＦＡ）进行比较。ＷＢ法对３／４标本在大鼠接种病毒后第３天测得血清ＩｇＭ阳性,而ＩＦＡ法仅１／４标本出现阳性,ＩＦＡ效价为１：５１２０的血清,ＷＢ效价为１’：４０９６０,且在血清１：１０稀释时反应带亦清晰。两种方法分别测定６４份大鼠血清。甩ＩＦＡ法,４４份（６８．８％）出现类似阳性的荧光颗粒,而用ＷＢ法测定,无特异的反应带出现。非感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作ＩＦＡ抗原,３０份（４６．９％）与正常细胞抗原有反应,此结果表明ＷＢ法在特异性和敏感性方面均高于ＩＦＡ法。ＩＦＡ法中的非特异性反应系血清与细胞成份之反应。     

TORCH系列病原体感染在产科的初步研究

本文应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测ＴＯＲＣＨ系列抗体,初步调查了产科孕产妇、异常妊娠史妇女及部分其它病人此类抗体水平。ＣＭＶ－ＩｇＭ阳性率,孕产妇１１．７％（６０／５４２）,不良妊娠史妇女２１．４３％（１５／７０）,其它病８．８２％（１５／１０７）;ＲＵＶ－ＩｇＭ阳性率孕产妇１５．７％（８５／５４２）,不良妊娠史妇女为３１．４％（２２／７０）;ＴＯＸ－ＩｇＭ阳性率分别为１６．９％（９２／５     

献血员巨细胞病毒感染的研究

用ＰＣＲ法和ＤＮＡ杂交法检测同一献血员的白细胞及血清中的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ,并用ＥＬＩＳＡ法检测血清中的ＨＣＭＶ－ＩｇＭ、ＩｇＧ（测四个不度）,连续两年共检测白细胞和血清样本各２００人份。ＰＣＲ法检测白细胞中的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性率分别为６３％和７０％,ＤＮＡ杂交法检测的阳性率为４２％和５０％。ＰＣＲ法检测血清中的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ的阳性率为４９％和５３％,ＤＮＡ杂交法检测的阳性率为３３％和３９％。Ｈ     

HCV核心蛋白免疫优势肽AA32—45抗原化抗体的构建

经定点突变,在抗ＨＢｓＡｇ单克隆抗体重链Ｖ区产生一个ＸｈｏＩ位点并插入编码ＨＣＶ核心蛋白免疫优势肽ＡＡ３２￣４５的互补寡核苷酸片段,构成抗原化ＶＨ基因。抗原化ＶＨ与人γ３恒区ｃＤＮＡ拼接成嵌合重链基因并与嵌合轻链基因共同构建成杆状病毒表达系统转移载体,经共转染筛选到重组病毒ＢａｃＨＬ－Ｅ１和ＢａｃＨＬ－Ｅ２,感染Ｓｆ９细胞分别表达Ｉｇ－Ｅ１和Ｉｇ－Ｅ２。Ｉｇ－Ｅ１与正常免疫球蛋白分子一样能形成四聚     

胸腺肽α_1活性片段和其自旋标记衍生物的合成及免疫活性研究

报道了胸腺肽α_１活性片段Ｔｈｙｍｏｓｉｎα_１［Ｌｙｓ（２３）］（２３－２７）ＯＨ和其自旋标记衍生物的合成及对实验动物免疫功能的影响。其氨基酸序列分别为Ｈ_２Ｎ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｇｌｕ－ＯＨ,用Ｔｈｙα_１［Ｌｙｓ~（２３）］表示,修饰物为Ｇｌｕ－ＯＨ）,用Ｔｈｙα_１［Ｌｙｓ~（２３）］·Ｒ表示。ＨＰＬＣ测得该肽的纯度在９０％以上,ＥＳＲ谱测定自旋标记衍生物给出氮氧自由基信号,氨基酸组成与预期值相符。实验小鼠腹腔连续注射剂量为０．１、１、１０、１００和１０００μｇ／ｋｇ的该肽１０天后,发现腹腔巨噬细胞吞噬功能、ＥＲＦＣ阳性率及血清溶血素含量明显升高,且最佳剂量在０．１－１０μｇ／ｋｇ范围。实验结果表明人工合成胸腺肽α_１活性片段及其自旋标记衍生物具有显著的免疫促进活性。     

利用GFP示踪细胞内源性P53活性检测DNA损伤

ＤＮＡ损伤的检测对预防癌症和遗传病等非常重要。采用分子克隆技术,将报告基因—绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）置于ＳＶ４０基本启动子调控下,构建成对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ。在ＳＶ４０基本启动子上游插入寡核苷酸Ｐ５３ＲＥ,构建成示踪载体ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ。转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以ＧＦＰ示踪细胞内源性Ｐ５３的转录激活活性。紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理转化细胞使ＤＮＡ损伤,诱导细胞内源性Ｐ５３的表达。用激光扫描共聚焦成像系统（ＬＳＣＩＳ）对细胞进行红、绿、蓝三色光融合成像,并测定ＧＦＰ经４８８ｎｍ激发后发出的绿色荧光光密度,验证ＧＦＰ示踪Ｐ５３的特异性。ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＲＥＧ经紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理后,ＧＦＰ的表达增高,处理后１ｈｒ光密度即达到最高水平,随后逐渐降低。血清“饥饿”—非ＤＮＡ损伤处理的３Ｔ３－ＲＥＧ细胞,以及经紫外和Ｈ２Ｏ２处理的对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＳＶＧ,ＧＦＰ的表达无明显增强。实验表明：ＧＦＰ示踪内源性Ｐ５３转录激活活性用于检测ＤＮＡ损伤有很高的灵敏度和特异性,适宜推广应用。