热带假丝酵母(Candida tropicalis)79微体(microbody)分离与特性的研究

本文报道利用正十五烷热带假丝酵母Candida tropicalis 79微体的诱导和分离。用分级离心和非连续蔗糖密度梯度离心技术,从对数生长期前期的热带假丝酵母原生质体中分离得结构完整的微体。经酶学和细胞化学分析表明,微体中具有很强的过氧化氢酶、尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶等活力和使3,3′-二氨基联苯(DAB)氧化聚合的能力,证实了过氧化氢酶等主要定位在微体上。电镜观察,微体是单膜结构的细胞器,在某些微体的基质中尚见到晶核(crystalline core)和类晶体(crystallo-id)等细微结构。微体中尚含有一定量的脱氧核糖核酸,提示了微体有遗传功能的可能性。     

三角酵母菌D-氨基酸氧化酶的纯化和一些基本性质的研究

1．比较了17株霉菌和36株酵母菌的D-氨基酸氧化酶活力,其中以三角酵母的酶活力最高,比较适宜作为研究D-氨基酸氧化酶的材料。 2．用硫酸铵、聚乙二醇(PEG 6000)分部沉淀,Sephadcx G-200、羟基磷灰石柱层析分离纯化了三角酵母D-氨基酸氧化酶,聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一组份。 以聚丙烯酰胺凝股梯度浓度电泳测得D-氢基酸氧化酶的分子量为170,000,sDs凝胶电泳测得其亚基分子量为42,000,表明三角酵母D-氨基酸氧化酶由四个相同亚基组或。 3．三角酵母D-氨基酸氧化酶在以D-丙氨酸为底物时,最适pH为8．3,米氏常数(Km)为3．3mM。三角酵母D-氨基酸氧化酶具有较宽的底物专一性,多种D或DL型氨基酸都可以做它的底物。     

尿素对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种形成微体的影响

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(co)N22的超显微形态、结构和长链二元酸合成的关系进行了研究。烷烃能诱导热带假丝酵母微体(microbody)的形成。在适量尿素(0.1％)存在下的烷烃发酵能合成大量长链二元酸,同时菌体内有很多微体出现,但在过量尿素(0.2％)存在下,则长链二元酸的合成和微体的形成均受抑制,说明微体的存在是长链二元酸合成的必要条件。由于微体对烷烃的利用和长链二元酸的合成有关,ω氧化酶系也可能定位于微体上。 在过量尿素(0.2％)存在下,微体的形成和长链二元酸的合成都被抑制,尿酸氧化酶也明显降低,但过氧化氢酶和D-氨基酸氧化酶都比适量尿素(0.1％)培养的菌体显著增加。这些结果指出,微体的出现和这三种所谓微体的“标志酶”的活力是不平行的。因此“标志酶”的提法值得商榷。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中 ,QβRNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶 ,是比较重要的应用酶种之一。该酶由 4个亚基组成 ,其中只有 β亚基是由病毒基因编码 ,而其他 3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时 ,得到的 β亚基几乎都是不溶性蛋白 ,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高 β亚基的溶解性 ,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33 rep ,同时利用pET2 1a( )为表达载体表达其他 3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDS PAGE分析表明 ,当 β亚基与EF Tu Ts亚基共表达时 ,溶解度有一定的提高 ,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度 ,相对增强可溶性 β亚基的表达 ,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高     

油菜叶片蛋白质组对机械损伤应答的初步分析

 植物在对抗昆虫的长期进化过程中形成了自我防御机制,能够产生特异的抗性蛋白来应对昆虫的取食。该文用机械损伤模拟害虫取食,研究和 对比了油菜(Brassica napus cv. Westar)在机械损伤前后可溶性总蛋白的含量变化并试图通过蛋白质组学技术来检测可能发生变化的蛋白质。 蛋白质定量检测发现,同一植株同一叶片损伤前后可溶性总蛋白含量差异显著,损伤后蛋白表达量增高。 蛋白质双向凝胶电泳及其差异显示分 析损伤前后的蛋白质组,表明有8个蛋白质点发生明显的上调或下调。选择其中2个差异蛋白点经过MALDI-TOF质谱鉴定,它们分别是Rubisco小 亚基前体、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和粪卟啉-3-氧化酶,这些蛋白质可能在油菜叶片应答机械损伤过程中对维持植物的生理功能起到重要作用 。     

鱼腥藻7120异形胞分化的调节及细胞蛋白的变化

分离了有固氮活性的异形胞,它的可溶部分和膜部分的吸收光谱与营养细胞明显不同。SDS凝胶电泳图谱表明,营养细胞中存在的可溶蛋白,在异形胞中有一半左右被降解,最明显的是藻蓝蛋白。异形孢具有与营养细胞共同的肽带,但也合成了一些新的多肽。异形胞可溶蛋白有五条最主要的肽带,表观分子量约为73K,54K,48K,4lK和34K。膜蛋白中至少有2个多肽带(4lK,35K)在营养细胞膜蛋白中是缺少的。     

板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件,从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理,比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法,制备的蛋白质样品经双向凝胶电泳后,在凝胶上呈现的蛋白质斑点的丰度和分布特点。结果表明,两种方法获得的蛋白质主要集中分布在pH4~7的范围内;TCA-丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少。裂解液-TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白质总量较大,通过cleanupkit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染蛋白点用MALDI-TOFMS/MS进行分析,可以得到高质量的肽质量指纹谱。表明该样品制备方法可以满足蛋白质鉴定的要求。     

成熟前后蟾蜍卵母细胞质膜、透明带和卵黄膜蛋白质组份的比较分析

手工分离激素体外诱发成熟的中华大蟾蜍长足卵母细胞质膜和卵黄膜,以及未经激素处理的卵母细胞质膜和透明带,通过SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,进行膜蛋白质组份比较分析。考马斯蓝染色显示:未经激素处理的卵母细胞,其质膜主要有六条蛋白带子,分子量范围为25K—250K道尔顿;透明带有四条主要蛋白质带,分子量范围为43K—250K道尔顿。激素作用后的成熟卵球质膜蛋白质组份与处理前相同;由透明带衍生形成的卵黄膜,显著增加一种分子量为20K道尔顿的蛋白质组份。卵母细胞膜表面的碘(~(125)I)化反应和电泳分析结果清楚地表明,不论透明带还是质膜,它们的不同分子量蛋白质带都能强烈地标记上~(125)I;去膜卵球部分的蛋白质成份,没有测出任何~(125)I标记峰。证明以上分析的蛋白质组份确是存在于膜的表面。     

金鱼(红龙睛)次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的分离及特性初步研究

 从金鱼肝脏分离并部分纯化了HGPRT。初步结果表明,该酶的分子量为78,000左右。由3个亚基组成,每个亚基的分子量约为27,000。金鱼的HGPRT很稳定,在85℃加热10分钟,至少保留80％的酶活性。该酶与PRPP的反应产物在淀粉凝胶电泳图谱上出现两条反应带。     

出芽短梗霉原生质体再生变异菌株的同工酶及可溶性蛋白的研究

用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对出芽短梗霉的亲本菌株及其４株原生质体再生菌株的脂酶、谷氨酸脱氢酶、细胞色素氧化酶和可溶性蛋白进行了比较。发现各变异菌株之间,变异菌株与亲本菌株之间的谱带均有差异,原生质体再生菌株的变异涉及酶蛋白的改变。     

雌核发育银鲫和两性生殖彩鲫精子蛋白组份的比较研究

对雌核发育银鲫和两性融合彩鲫精子蛋白组份进行了比较分析。通过分级抽提得到精子的不同组份精浆、精头的膜、鞭毛和脱膜精头等,然后经不同的凝胶电泳系统,比较分析了银鲫精子和其两性亲缘种彩鲫精子相应组份可溶性蛋白成份的差异。研究表明,经分级抽提的银鲫精子和彩鲫精子的各个组份都含有其特定的蛋白谱带。精浆蛋白在两种鱼之间和两种鱼的不同个体之间都存在一定差异。精头膜、鞭毛和脱膜精头的可溶性蛋白在同种鱼不同个体间高度一致,但在两种鱼之间表现出差异。两种鱼精头膜的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上基本一致,而在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱上则具有各自的特征性谱带。鞭毛可溶性蛋白的SDS－PAGE分析在雌核发育银鲫中揭示出一条特异的蛋白带。脱膜精头的可溶性蛋白在SDS－PAGE电泳图谱上差异明显,存在几条特征性蛋白带,并经Acid-Urea PAGE系统分析,证实这些特征性蛋白为碱性蛋白。这些发现为进一步鉴定雌核发育银鲫雄鱼精子的特异性蛋白和揭示其分子机制打下了基础。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中,Qβ RNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶,是比较重要的应用酶种之一。该酶由4个亚基组成,其中只有 β亚基是由病毒基因编码,而其他3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时,得到的β亚基几乎都是不溶性蛋白,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高β亚基的溶解性,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33rep,同时利用pET21a(+)为表达载体表达其他3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDSPAGE分析表明,当β亚基与EFTuTs亚基共表达时,溶解度有一定的提高,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度,相对增强可溶性β亚基的表达,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高。     

尿酸氧化酶基因的克隆、表达及其产物的应用

克隆了产朊假丝酵母(Candida utilis)AS2-117尿酸氧化酶(Urate Oxidase,Uricase,EC1.7.3.3)的基因。将此基因插入原核表达质粒pET21a后转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达的重组转化子菌株。经IPTG诱导,重组尿酸酶基因表达量可达菌体可溶性蛋白的40%。重组尿酸氧化酶为有酶活性的可溶蛋白。Western印迹分析证实表达产物有免疫学活性。经DEAE DE52纤维素离子交换柱层析纯化,目的蛋白纯度可达95%。重组蛋白和天然蛋白的理化特征比较证明重组蛋白的热稳定性有较大提高。酶盒配制和临床应用实验表明重组蛋白可代替天然蛋白进行临床血清尿酸的分析。     

细胞内、外源活性氧致人多形核白细胞膜理化特性改变的研究

DPH和N-(3芘)马来酰亚胺标记光敏氧化反应及黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应生成外源性单线态氧(O_2)和超氧阴离子自由基(O_2)作用人多形核白细胞膜脂及膜蛋白质、荧光激发发射光谱形状、峰位未发生改变,荧光强度减小,其中以N-(3芘)马来酰亚胺标记O_2作用的膜蛋白质更为明显.荧光偏振度增大,相应清除剂L-组氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶有抑制效应.调理的酵母多糖刺激中性粒细胞呼吸爆发产生膜、胞内活性氧损伤膜脂、膜蛋白质,测定荧光参数变化与前者不尽相同,DPH荧先强度显著增加,L-组氨酸,超氧化物歧化酶和过氧化氢酶似无抑制效果.     

带3蛋白C端和血型糖蛋白A相互作用及其抗原相关性的研究

采用高效液相色谱法分离鉴定了红细胞膜蛋白质跨膜域的亲水性肽链,结果显示血型糖蛋白A(GPA)Lys101～Asp130与带3蛋白有相关性.为进行深入研究,采用RT-PCR方法从K562细胞中扩增了410 bp的GPA基因,分别克隆到酵母双杂交BD端表达质粒和杆状病毒转移载体上.同时,以含有带3蛋白全长基因的质粒为模板扩增了348 bp的带3蛋白C端基因,将其克隆到酵母双杂交AD端表达质粒.经酵母双杂交营养缺陷培养选择和β半乳糖苷酶检测证实GPA与带3蛋白之间存在相互作用.GPA表达产物分别经抗带3蛋白和抗GPA抗体进行蛋白质印迹分析,表明二者具有免疫交叉反应.上述结果表明带3蛋白与GPA在结构与功能上存在着密切联系.     

实验性糖尿病大鼠肝过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及D-双功能蛋白活性变化的初步研究

为研究过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及D-双功能蛋白在糖尿病脂代谢紊乱中所起的作用,分析了链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体数量和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化及D-双功能蛋白活性的改变,并用蛋白质印迹检测过氧化氢酶和D-双功能蛋白的表达量.发现糖尿病大鼠肝脏过氧化物酶体增殖,过氧化氢酶蛋白量和酶活性显著增加,过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强,D-双功能蛋白含量和酶活性显著降低,脂酰CoA氧化酶、L-3-羟脂酰CoA脱氢酶活性显著增加.对过氧化物酶体脂肪酸β-氧化增强和D-双功能蛋白活性降低与糖尿病脂代谢紊乱的关系进行了初步探讨.     

草鱼和鲤鱼线粒体 DNA 的分离纯化及其 COI 基因的分子克隆

本文报道配合使用差速离心和DNaseI核酸酶处理等步骤,从草鱼和鲤鱼新鲜肝组织分离线粒体DNA(mtDNA)的实验方法。这种方法经济简便,纯化的mtDNA产率多,纯度高,经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳分离,可以得到清晰的DNA片段谱带,并可直接用于构建酶切图谱和线粒体基因的分子克隆。用这样的mtDNA,我们已克隆了草鱼和鲤鱼的细胞色素氧化酶亚基I基因(COI基因)。     

K562耐药细胞的建立及相关蛋白表达改变的研究

为研究肿瘤细胞发生多药耐药后蛋白整体水平表达的改变,将K562细胞与阿霉素(ADR)共同培养,逐渐增加药物浓度,最后建立耐阿霉素的细胞K562／ADR株。MTT法检测阿霉素(ADR)、顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)和长春新碱(VCR)对K562和K562／ADR细胞的半数抑制率(IC50)。利用蛋白质组学技术,通过双向凝胶电泳分离K562和K562／ADR细胞的总蛋白,银染显色,分析差异蛋白,对部分蛋白点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析飞行时间质谱法得肽质量指纹图谱,用AutoMS-Fit软件查询NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果表明K562细胞经ADR诱导后出现多药耐药现象,ADR、DDP、5-FU和VCR对K562／ADR细胞的IC50明显高于K562。将K562和K562／ADR的双向电泳图谱进行差异比较,初步鉴定仅在K562／ADR图谱上出现的蛋白是一些与细胞分裂、基因转录有关的蛋白质。这些蛋白的变化与耐药细胞的特性相关,可能与临床化疗的多药耐药现象有联系。     

尿酸氧化酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

尿酸氧化酶(urate oxidase,Uricase,EC.1.7.3.3)是一种能将尿酸氧化为尿囊素的蛋白酶。合成黄曲霉(Aspergillus flavus)尿酸氧化酶基因,构建表达载体pET43.1a/uox,重组质粒经双酶切鉴定和序列分析,证明插入序列正确,转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109,菌株经诱导表达尿酸氧化酶蛋白,目的蛋白经过超声破碎,经检测以可溶性蛋白为主;菌体经超声破碎后,上清经过阴离子柱和阳离子柱两步纯化,得到尿酸氧化酶纯品,纯品以分光光度法进行体外酶活性测定。结果显示:尿酸氧化酶在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占菌体总蛋白的50%;表达产物经过两步层析柱纯化,获得电泳扫描纯度为95%的纯品;在体外活性测定中具有分解尿酸的能力,在临床检测和治疗中有重要意义。     

极低频磁场对人乳腺癌细胞蛋白质表达谱的影响

极低频磁场(ELF MF)被国际癌症研究中心列为可疑致癌物, 但其诱发肿瘤的具体机制并不清楚. 为此, 采用蛋白质组技术研究人乳腺癌细胞MCF7受ELF MF辐照后蛋白质表达谱的变化, 以探索确定该细胞的极低频磁场反应蛋白质. 在将MCF7细胞暴露于50 Hz, 0.4 mT正弦极低频磁场中24 h后, 直接抽提蛋白, 进行双向凝胶电泳. 凝胶经银染后, 使用PDQuest软件分析假辐照组与磁场辐照组间差异表达蛋白质斑点. 结果显示, 与假辐照组相比, 磁场辐照组中有6个蛋白质斑点的表达量发生显著改变(至少5倍的增加和减少), 同时, 在磁场辐照组中有19个蛋白点消失和19个新蛋白点出现. 通过搜索SWISS-PROT蛋白数据库, 对差异蛋白的类别和功能进行了初步推测. 在此基础上, 进一步选择3个差异表达蛋白斑点, 经胶内酶解后, 进行串联质谱分析, 分别鉴定为RNA结合蛋白调节亚基、 蛋白酶体β亚基7型前体和翻译调控肿瘤蛋白. 结果表明, 50 Hz, 0.4 mT极低频磁场辐照24 h改变了MCF7细胞内多种蛋白的表达水平, 影响环节涉及基因转录、蛋白翻译、蛋白代谢、功能蛋白相互作用等多个层面, 说明极低频磁场可能作为一种环境应激因素改变细胞的正常生理功能.