蛋白芯片载体表面修饰对探针固定影响的研究

采用3-氨基丙基-三甲氧基硅烷((3-aminopropyl)trimethoxysilane,APTES)、戊二醛(glutaraldehyde,GA)、多聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)修饰芯片载体表面,对3种不同修饰方法制备的蛋白质芯片进行对比研究。将Cy3标记羊抗鼠IgG固定在修饰后片基上,选择蛋白探针的固定率作为检测指标;将小鼠IgG作为探针固定在芯片上,靶蛋白为Cy3标记羊抗鼠IgG,通过生物芯片扫描仪检测反应后荧光强度,选择蛋白探针的反应性作为检测指标,探讨制备蛋白质芯片较佳的表面修饰方法。结果显示,戊二醛修饰玻片对蛋白固定较好,有较高的反应活性,检测限较宽,但背景噪声较高。     

基于IgG检测为模型的玻璃介质定量蛋白质芯片的研制及评价

为研制高通量定量检测的蛋白质芯片,以人血清IgG为研究模型,选择戊二醛基修饰的玻片为载体,蛋白质样品溶解于20%甘油的PBS,由机械手将浓度为0.5g/L人IgG单克隆抗体点样在玻片上,人血清白蛋白为阴性对照,以1%的BSA为封闭液对蛋白质芯片进行封闭,并经相应处理,构建用于定量检测人血清IgG蛋白质芯片.先以不同浓度IgG标准品为待测样品,建立蛋白质芯片方法和ELISA方法的标准曲线,两条标准曲线的R2值分别为0.996和0.994(P<0.01).两种方法的检测人IgG结果有很好的相关性(R2=0.9937,P<0.01),其敏感性均在15.625μg/L.用两种方法分别检测10例人血清IgG,结果显示两种方法的检测的IgG浓度有很好的一致性,以玻片为载体的蛋白质芯片可用于微量生物样品的定量检测.     

蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响

蛋白质的O位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化修饰是一种新近发现的广泛存在于细胞核蛋白与细胞浆蛋白的蛋白质翻译后修饰.其性质与经典的膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰不同,而与蛋白质磷酸化修饰更相似.O-GlcNAc糖基化和磷酸化均修饰tau蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基,通过改变O-GlcNAc糖基化供体底物浓度以及其关键酶活性等方法,改变分化后成神经细胞样的PC12细胞中的蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰水平,然后用特异性识别不同位点磷酸化的tau蛋白抗体,进行蛋白质印迹分析来检测tau蛋白磷酸化水平的变化.结果发现细胞内蛋白质O-GlcNAc糖基化对tau蛋白磷酸化的影响,在不同的磷酸化位点其影响不同.增加蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰导致tau蛋白大多数磷酸位点的磷酸化水平降低,反之亦然.这些结果说明,tau磷酸化在大多数位点受到O-GlcNAc糖基化修饰的负性调节.这一研究为阐明调节tau蛋白磷酸化水平的机理和阿尔茨海默病脑中tau异常过度磷酸化的分子机制提供了新的线索.     

蛋白质修饰剂对盐藻光合作用的影响

经蛋白质化学修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、丁二酮（BTO）和对-氯汞苯甲酸（ρCMB）处理的盐藻细胞光合速率下降,0.17mmol/L的ρCMB和0.07mmol／L的NBS可完全抑制光合放氧。在藻细胞的可见光（400—700nm）区吸收光谱中,三种修饰剂都降低了整个波段的吸收。在两个主要吸收峰中,678nm吸收值的下降略大于436nm的下降。在紫外光谱区（200—300nm）,ρCMB和BTD使原吸收峰（203nm）值明显降低,NBS处理使吸收峰红移13nm。细胞胀破后紫外光谱出现更显著变化,峰位移至223nm（BTD）、250nm（NBS）,或至214—237nm而呈一个宽的平台（ρCMB）。紫外差示吸收光谱显示210nm的负峰;随修饰剂浓度增大,负差示峰可移到225nm（NBS）、245．5nm（ρCMB）和212nm（BTD）。     

蛋白质芯片的研究进展

蛋白质芯片是近年来兴起的生物检测技术,本文简要综述了该技术的发展概况、基本原理及在基础研究和疾病诊断中的初步应用,并指出了存在的问题及发展前景。     

O-GlcNAc修饰蛋白质的生理功能和研究方法

氧连N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰是与磷酸化相类似的蛋白质翻译后修饰方式,它主要发生在细胞核和细胞质中的蛋白质上．与细胞信号通路密切相关,成为近年来的研究热点。该文主要从O-GlcNAc修饰蛋白质的生理功能和研究方法两方面介绍该领域近年来的研究成果。     

蛋白质的棕榈酰化修饰

棕榈酰化修饰是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式,是调控蛋白质的转运、稳定、定位和功能的重要机制,同时,棕榈酰化修饰还参与多种细胞生物学进程,与许多疾病的发生发展密切相关。本文主要就蛋白质棕榈酰化及其修饰酶与蛋白质功能、相关疾病的关系做一综述。     

蛋白质多肽类药物的脂肪酸修饰研究进展

随着基因工程技术的发展,蛋白质多肽药物的应用越来越受到人们的青睐。但此类药物具有血浆半衰期较短、免疫原性较强等不足 之处,在很大程度上限制了其临床应用。因此,研究人员尝试采用各种化学方法对蛋白质多肽类药物加以修饰,以弥补这一不足。与 PEG 修饰、 糖基化修饰、定点突变等方法相比,脂肪酸修饰除了可获得良好的生物活性、提高稳定性、降低免疫原性外,更重要的是由于脂肪酸是构 成人体脂肪、类脂和细胞膜磷脂的重要成分,可有助于提高药物的脂溶性,增大肠道黏膜透过性,增强药物与受体的结合。对蛋白质多肽 药物的脂肪酸修饰研究进展进行综述。     

蛋白质点阵/芯片技术的新进展

蛋白质点阵/芯片技术是分子生物学技术的重要进展,在功能蛋白质组研究方面具有广阔的潜在应用价值.目前发展起来的印迹蛋白微阵列、分子扫描技术和传感器生物芯片质谱,将应用于药靶检测、疾病诊断、蛋白质结构鉴定和/或蛋白质之间的相互作用分析等方面,具有分析速度快、效率高、样品消耗少等特点,将成为生命科学与医学领域新的研究工具.     

无细胞蛋白质芯片的制备及其应用

蛋白质芯片是生物技术和功能蛋白组学的关键技术之一. 传统的生产蛋白的方 法周期长且费用高. 无细胞蛋白质合成系统和蛋白芯片的结合, 避免了基因的克隆、 蛋白的表达、纯化和保存等繁琐过程, 使整个无细胞蛋白芯片的制备过程快捷、迅速 和高效. 本文详细综述了无细胞蛋白质合成系统及其分类、无细胞表达系统在制备蛋 白质芯片方面的研究进展, 并探讨了无细胞蛋白质芯片在蛋白组学研究中的最新应用.     

芯片数据标准化方法比较研究

在基因芯片实验中,基因表达水平之间的相关性在推断基因间相互关系时起到非常重要的作用.未经标准化处理的芯片数据基因之间往往都呈现出很强的相关性,这些高相关性一部分是由基因表达水平变化引起的,而另外一部分是由系统偏差引起的.对芯片数据进行标准化处理的目的之一是消除系统偏差引起的高相关性,同时保留由真正生物学原因引起的基因表达水平高相关性.虽然目前对标准化方法已经有了不少比较研究,但还较少有人研究标准化方法对基因之间相关系数的影响,以及哪种方法最有利于恢复基因之间的相关性结构.通过对基因表达水平数据的模拟,具体比较了几种常用标准化方法的效果,从而给出最有利于恢复基因之间相关性结构的那种标准化方法.     

AFP蛋白芯片技术的检测流程优化

目的:通过优化现有的蛋白芯片检测过程,在保证检测准确性的同时缩短甲胎蛋白(Alpha Fetal protein,AFP)的检测时间,提高检测效率,为原发性肝癌的筛查提供经济、便捷、省时、有效的检测方法。方法:本研究在传统蛋白芯片检测流程(1-1.5小时)的基础上,通过优化检测流程将检测时间缩短至18分钟,并且通过和传统方法进行比较,评价该优化方法的检测效能。结果:与传统蛋白芯片检测方法相比,本优化方法的检测时间缩短至18分钟。重复检测同一样本,传统方法 AFP水平为16.50±1.172ng/m L,优化方法 AFP水平为18.33±1.029 ng/m L,结果无明显统计学差异(P=0.251)。结论:本研究成功地优化了AFP的蛋白芯片检测流程,在缩短检测时间的同时,保证了检测的准确率,是一种经济省时易操作的AFP检测方法。     

生物素-亲和素偶联探针蛋白芯片检测技术

自行制备一种新型生物素-亲和素偶联探针分子并用于反相蛋白芯片的检测。首先, 将生物素-羊抗鼠IgG与亲和素按照不同比例混合后与鼠IgG蛋白芯片反应, 观察荧光信号的放大情况; 然后以鼠IgG-羊抗鼠IgG体系为研究模式, 对反相蛋白芯片的制备条件进行了考察和优化, 包括荧光分子的非特异性吸附、点样缓冲液的选择以及蛋白的活性等。最后, 采用此偶联探针对反相蛋白芯片进行了检测。结果表明, BSA缓冲液制备的反相蛋白芯片可以防止非特异性吸附, 并有利于保持固定蛋白活性和提高检测限; 另外, 与传统的与生物素-亲和素检测技术相比, 采用生物素-亲和素偶联探针对反相芯片的检测限可以提高4倍左右。表明亲和素-生物素偶联探针成本低、易于合成、并可以与其它的信号放大技术联用进一步提高检测的灵敏度, 有望用于蛋白质芯片的检测。     

生物素-亲和素偶联探针蛋白芯片检测技术

自行制备一种新型生物素-亲和素偶联探针分子并用于反相蛋白芯片的检测。首先, 将生物素-羊抗鼠IgG与亲和素按照不同比例混合后与鼠IgG蛋白芯片反应, 观察荧光信号的放大情况; 然后以鼠IgG-羊抗鼠IgG体系为研究模式, 对反相蛋白芯片的制备条件进行了考察和优化, 包括荧光分子的非特异性吸附、点样缓冲液的选择以及蛋白的活性等。最后, 采用此偶联探针对反相蛋白芯片进行了检测。结果表明, BSA缓冲液制备的反相蛋白芯片可以防止非特异性吸附, 并有利于保持固定蛋白活性和提高检测限; 另外, 与传统的与生物素-亲和素检测技术相比, 采用生物素-亲和素偶联探针对反相芯片的检测限可以提高4倍左右。表明亲和素-生物素偶联探针成本低、易于合成、并可以与其它的信号放大技术联用进一步提高检测的灵敏度, 有望用于蛋白质芯片的检测。     

基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱比较

评估采用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面侵袭和转移相关特征性糖谱的适用性．首先选取一对模式细胞株(中华仓鼠卵巢细胞CHO和其N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ缺陷株Lec1)验证凝集素芯片系统的可靠性．然后通过凝集素芯片比较正常肝细胞L02、非转移肝癌细胞Hep3B、高转移肝癌细胞HCCLM3的细胞表面糖谱,同时采用细胞凝集素组织化学的方法验证芯片结果．细胞Hep3B和L02相比,对凝集素PHA-L、ConA、AAL、MPL的亲和作用增强而对凝集素WGA的亲和作用减弱,提示在肝癌细胞表面可能出现了增多的复杂寡糖分支、高甘露糖、末端岩藻糖、黏蛋白T抗原和减少的N-乙酰葡萄糖胺和/或多价唾液酸结构．细胞HCCLM3和Hep3B相比,对凝集素LCA、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA、PHA-E的亲和作用增强而对凝集素RCA-I的亲和作用减弱,提示在高转移肝癌细胞HCCLM3的表面可能出现了增多的核心岩藻糖、唾液酸(主要是α2-3链接方式)、N-乙酰葡萄糖胺、平分型GlcNAc结构以及减少的末端β1-4链接半乳糖结构．细胞凝集素组织化学的结果支持芯片结果．研究证明,凝集素芯片技术是解析生物学进程中糖谱改变的适用工具．     

两种跨膜蛋白携带myc于细胞表面的能力比较

在细胞表面表达具有某种功能的蛋白后,这些细胞就具备了某些新功能,可以对其进行功能研究和应用.将功能蛋白连接到某些跨膜蛋白的胞外区是实现目的蛋白表达于细胞表面的手段之一.本研究比较了2种跨膜蛋白A2TM和△LNGFR携带外源蛋白-myc于细胞表面的能力.利用重叠PCR法合成的A2TM和△LNGFR基因片段与载体pEF/myc/ER和载体LL3.7进行酶切、连接、转化、鉴定,成功构建了pEF-A2TM、pL-A2TM和pL-LN真核表达载体.利用磷酸钙沉淀法转染293FT细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达、流式细胞术检测myc在细胞表面的表达情况,Western blotting检测myc目的蛋白的表达.pL-A2TM和pL-LN转染293FT细胞36 h后的荧光强度基本相同,表明A2TM和△LNGFR在细胞内表达的强度相似.流式细胞术分析显示,△LNGFR和A2TM均可在细胞表面表达,但A2TM只有在指示蛋白EGFP表达非常高的情况下才能在细胞表面被检测到.Western blotting显示△LNGFR表达量很高,而A2TM没有达到检测水平.结果表明,以糖基化形式存在的△LNGFR比没有糖基化的内源A2TM的表达更稳定,A2TM在表达量低时可能易被细胞内的蛋白酶降解,因而△LNGFR是一种能携带外源蛋白于细胞表面的比较理想的跨膜蛋白.     

Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing

The current prognosis and classification of CRC relies on staging systems that integrate histopathologic and clinical findings. However, in the majority of CRC cases, cell dysfunction is the result of numerous mutations that modify protein expression and post-translational modification¹.A number of cell surface antigens, including cluster of differentiation (CD) antigens, have been identified as potential prognostic or metastatic biomarkers in CRC. These antigens make ideal biomarkers as their expression often changes with tumour progression or interactions with other cell types, such as tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) and tumour-associated macrophages (TAMs).The use of immunohistochemistry (IHC) for cancer sub-classification and prognostication is well established for some tumour types^2,3. However, no single ‘marker’ has shown prognostic significance greater than clinico-pathological staging or gained wide acceptance for use in routine pathology reporting of all CRC cases. A more recent approach to prognostic stratification of disease phenotypes relies on surface protein profiles using multiple ''markers''. While expression profiling of tumours using proteomic techniques such as iTRAQ is a powerful tool for the discovery of biomarkers4, it is not optimal for routine use in diagnostic laboratories and cannot distinguish different cell types in a mixed population. In addition, large amounts of tumour tissue are required for the profiling of purified plasma membrane glycoproteins by these methods. In this video we described a simple method for surface proteome profiling of viable cells from disaggregated CRC samples using a DotScan CRC antibody microarray. The 122-antibody microarray consists of a standard 82-antibody region recognizing a range of lineage-specific leukocyte markers, adhesion molecules, receptors and markers of inflammation and immune response⁵, together with a satellite region for detection of 40 potentially prognostic markers for CRC. Cells are captured only on antibodies for which they express the corresponding antigen. The cell density per dot, determined by optical scanning, reflects the proportion of cells expressing that antigen, the level of expression of the antigen and affinity of the antibody⁶. For CRC tissue or normal intestinal mucosa, optical scans reflect the immunophenotype of mixed populations of cells. Fluorescence multiplexing can then be used to profile selected sub-populations of cells of interest captured on the array. For example, Alexa 647-anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM; CD326), is a pan-epithelial differentiation antigen that was used to detect CRC cells and also epithelial cells of normal intestinal mucosa, while Phycoerythrin-anti-CD3, was used to detect infiltrating T-cells⁷. The DotScan CRC microarray should be the prototype for a diagnostic alternative to the anatomically-based CRC staging system.     

蛋白质翻译后修饰研究进展

翻译后修饰在蛋白质加工、成熟的过程中发挥着重要的作用,它可以改变蛋白质的物理、化学性质,影响蛋白质的空间构象、立体位阻及其稳定性,进而对蛋白质的生物学活性产生作用,引起蛋白质的功能改变。修饰基团自身的结构特性对蛋白质的性质、功能也会产生深远的影响。在已有的研究基础上,综述蛋白质翻译后修饰的主要类型以及各修饰作用潜在的生物学功能。