反义RNA抑制猪传染性胃肠炎病毒复制的研究

根据反义RNA作用原理,设计一条互补猪传染性胃肠炎病毒基因(26888—27184)区的反义RNA序列。将该序列与逆转录病毒表达载体构建成质粒PLXSN—N5’,并与质脂体共转染PA317细胞,经G418(500μg／ml)筛选出稳定的产毒细胞克隆。取其上清液感染小鼠成纤维细胞NIH3T3,测定细胞克隆产生的假病毒滴度,用高滴度假病毒感染IBRS2细胞。提取被感染的IBRS2细胞总DNA和RNA,通过PCR和RT_PCR证明PL,XSN—N5’整合到IBRS2细胞基因组。病毒感染细胞病变表明,反义RNA有明显抑制TGEV复制的作用。     

猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道疾病,可导致仔猪发生严重的呕吐、腹泻与脱水,死亡率可达100%。口服疫苗是TGEV基因工程疫苗研究的主要方向,目前已在腺病毒、细菌、转基因植物及DNA疫苗中对TGEV的S基因进行了表达,并对其口服免疫后的免疫原性进行研究。现针对TGEV基因工程疫苗近年来研究的概况进行综述,分析其优点与不足,并对其未来的发展进行展望。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核衣壳(N)蛋白的纯化

通过对大肠杆菌表达,经载体pPROEXHTb克隆的TGEV重组N蛋白纯化方法中一系列条件的探索,最终得到了纯化融合蛋白的最佳优化方法。即在裂解液中含有1mM PMSF的条件下,分别经过2倍体积的bufferA和bufferB洗脱后,再收集pH5．9,含有80mM咪唑的1倍体积bufferC洗脱液,在波长280nm处检测蛋白吸收值A,再将峰值经SDS－PAGE电泳分析,可得到纯度较高的融合蛋白。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

采用ST细胞培养,免疫荧光、理化试验、中和试验、电镜观察等方法,从四川疑似猪腹泻病料中分离到1株猪传染性胃肠炎病毒,命名为SC-Y.分离株在ST细胞上盲传至第8代时可出现稳定的细胞病变,病毒滴度TCID50为10-3.664/0.05m1,中和指数为52.应用长链RT-PCR技术成功地扩增出了覆盖SC-Y株全长基因组的5个片段,通过BioEdit软件对测序结果进行拼接,确认SC-Y株基因组全长28 590bp,包括7个开放阅读框,基因组5非编码区长315nt,3'端非编码区长277nt.TGEV基因组系统进化树显示,SC-Y株与美国Purdue株可能来源于共同的祖先.     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点分子特征分析

为了进一步研究猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的分子特征,选取GenBank中22株TGEV分离株,采用生物信息学方法对抗原位点氨基酸序列进行同源性比对分析。结果表明,不同分离株的A和C位点高度保守,B和D位点则有一些变化。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gas-troenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1]。猪传染性胃肠炎病毒隶属于冠状病毒科冠状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原,其基因组为单股正链的有感染性不分节段的RNA,TGEV结构蛋白主要由S、N、Ms、M蛋白组成[2]。其中n基因指导合成病毒的核衣壳蛋白(N),它是一种磷酸化的蛋白,存在于病毒粒子的内部,其分子质量为47kD[3],与病毒基因组组成核衣壳;N…     

反义RNA抑制活化癌基因表达的研究

本文将构建的活化癌基因Ｔ２４－ｒａｓｃＤＮＡ的正、反义真核表达重组体,按先正义后反义和先反义后正义的不同转染顺序,转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,经药物筛选,建立细胞系。通过细胞形态及生物学特性观察、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验、软琼脂集落形成实验和Ｐ２１蛋白表达量的检测等实验对转化细胞进行了研究。结果表明：本室构建的正义重组体能诱导ＮＩＨ３Ｔ３细胞转化,而反义重组体可有效抑制这一转化,并且抑制效果与正、反义质粒转染的先后顺序有关。     

烟草花叶病毒装配起始位点反义RNA表达型中间载体的构建

利用基因工程方法培育抗病毒植物新品种的途径之一,是在植株中建立一个产生病毒基因组功能片段的反义RNA的系统。本工作设计并合成了一段烟草花叶病毒(TMV)装配起始位点反义RNA的基因,再以pBR 325为基本质粒,构建了包含带有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子和PolyA信号的反义RNA表达单元,以及为筛选转基因植株所必须的NPT-Ⅱ表达单元的中间载体,为以后经土壤农杆菌而获得转基因烟草植株打下了基础。     

尿激酶受体反义RNA抑制人乳腺癌细胞的侵袭作用

将尿激酶受体 u PAR反义 RNA表达质粒 p URAS以脂质体法转染高侵袭性人乳腺癌细胞株 MDA- MB- 2 31 ,G41 8筛选抗性克隆 .Northern印迹法检测 u PAR反义 RNA的表达 ,RT- PCR法检测 u PAR的表达 ,牛奶板法测定细胞培养上清中纤溶活性 .改良 Boyden小室模型和裸小鼠乳房脂肪垫接种试验分别检测肿瘤细胞体外和体内侵袭能力 .反义克隆细胞能表达 u PAR反义RNA,其 u PAR表达水平及培养上清中纤溶活性明显降低 .反义细胞克隆体外侵袭能力比原代细胞 MDA- MB- 2 31和转染载体细胞克隆显著降低 .裸小鼠体内侵袭实验表明 ,反义细胞克隆的成瘤性、生长性和侵袭性均显著受到抑制 .u PAR至少在一部分恶性乳腺癌侵袭行为中发挥重要作用 ,反义 RNA可望成为抗肿瘤侵袭治疗的一种有效手段 .     

反义RNA抑制人黑色素瘤细胞表面粘附分子CD44的表达及抑瘤效应

将细胞表面粘附分子ＣＤ４４Ｓ的ｃＤＮＡ反向插入到真核细胞表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ－ＣＡＴ和ＭＭＴＶ－ＬＴＲ启动子下游,构成ＣＤ４４Ｓ的反义ＲＮＡ载体．将其用电击法导入ＣＤ４４＋的人黑色素瘤细胞系ＨＭＭ２３９,转录出的反义ＲＮＡ能不同程度地抑制ＨＭＭ２３９表面ＣＤ４４的表达．ＣＤ４４的表达被抑制后,瘤细胞与透明质酸的结合力下降,细胞的体外生长速率不受影响．将其接种裸鼠皮下,发现其致瘤性明显降低     

应用反义RNA技术降低肿瘤细胞的耐药性

细胞内的Ｏ６－甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ甲基转移酶（ＭＧＭＴ）能够修复亚硝脲药物造成的ＤＮＡ损伤,阻止亚硝脲药物对肿瘤的杀伤作用,使细胞对亚硝脲药物产生耐药性．我们曾经构建了三个表达ＭＧＭＴ反义ＲＮＡ的逆转录病毒载体,导入对亚硝脲呈抗性的ＨｅＬａＳ３细胞,并...     

反义RNA技术在花色育种中的应用

反义RNA技术是用反义RNA链去抑制靶基因的活性,从而达到对目的基因调控的一项分子生物学技术.该项技术应用于观赏植物的花色育种已有16年的历史并且取得了一定的成就.到目前为止,已经利用该技术对14种花卉花色形成过程中的3大类基因进行了正义和反义导入,获得了花色改变的转基因植株.本文简要回顾了反义RNA技术的产生与发展,并在介绍花色形成的分子生物学的基础上,综述了国际园艺育种中利用反义RNA技术调控花色基因表达的研究进展,以期为花色改良的分子育种提供参考资料.     

反义RNA对人胃癌细胞生长抑制及恶性表型的阻断作用

ｒａｓ原癌基因的点突变是人胃癌发生发展的重要机理之一。利用能表达ｃ－Ｈ－ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ的质粒,导入人胃癌细胞系ＢＧＣ－８２３,研究了ｒａｓ癌基因反义ＲＮＡ对人胃癌细胞生长及恶性表型的作用,结果表明,ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ可引起ＢＧＣ－８２３生长速率及形态的变化,在半固体培养基中细胞集落形成能力减弱,部分地抑制了ＢＧＣ－８２３在裸鼠体内的致瘤性。ｃ－Ｈ－ｒａｓ反义ＲＮＡ对其ＲＮＡ的过量表达呈特异性抑制作用。     

一种降刺猬内源性脂蛋白(a)反义靶向连接物

通过酶联免疫法测定了刺猬体内脂蛋白（ａ）的含量,从中选出一些脂蛋白（ａ）水平较高的刺猬,研究脱唾液酸糖蛋白－多聚赖氨酸－反义载脂蛋白（ａ）ＲＮＡ连接物对刺猬内源性脂蛋白（ａ）的降低作用．结果表明,该连接物可明显降低刺猬体内脂蛋白（ａ）的水平,而脱唾液酸糖蛋白－多聚赖氨酸－正义载脂蛋白（ａ）ＲＮＡ连接物对刺猬体内脂蛋白（ａ）无降低作用,无脱唾液酸糖蛋白靶向的反义载脂蛋白（ａ）ＲＮＡ寡核苷酸对刺猬体内脂蛋白（ａ）的降低作用明显低于有脱唾液酸糖蛋白靶向的连接物．连接物几乎不影响刺猬体内的纤维蛋白溶酶原的活性,连接物对刺猬脂蛋白（ａ）的降低作用至少可持续１６ｈ．