海藻糖酶基因TRE2-like和TRE2在异色瓢虫羽化过程中的表达与功能

【目的】异色瓢虫Harmonia axyridis是一种重要的捕食性天敌昆虫,海藻糖在异色瓢虫的变态发育、羽化等整个生命过程都起着重要的作用。本研究以前期获得的类似膜结合型海藻糖酶(TRE2-like)与膜结合型海藻糖酶(TRE2)基因为基础,探讨在异色瓢虫羽化阶段这两个海藻糖酶的潜在功能,为阐明异色瓢虫从蛹发育到成虫时海藻糖代谢机制提供参考。【方法】根据TRE2-like和TRE2基因序列设计双链RNA(dsRNA)区域片段并合成对应的dsRNA,通过RNAi将其注射到异色瓢虫2日龄蛹中。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫糖代谢相关基因的表达;同时采用蒽酮比色法、酶标法等分别测定RNAi处理后羽化第1天的异色瓢虫成虫主要糖类物质含量及TRE活性变化,并观察异色瓢虫羽化后的表型变化。【结果】结果表明,与对照组(dsGFP注射组)相比,异色瓢虫2日龄蛹被注射TRE2-like或TRE2 dsRNA后,其新羽化成虫体内TRE2-like和TRE2表达量均极显著下调,且少数个体出现了蜕皮与翅形成困难等畸形表型。可溶性海藻糖酶活性在注射dsTRE2-like后显著降低,膜结合型海藻糖酶活性在注射dsTRE2后显著降低;注射dsTRE2后糖原含量显著下降,注射dsTRE2-like后糖原和海藻糖含量显著下降,注射dsTRE2-like+dsTRE2后糖原和葡萄糖含量显著下降,且海藻糖含量极显著下降。注射dsTRE2-like, dsTRE2和dsTRE2-like+dsTRE2后可溶性海藻糖酶基因TRE1-1和TRE1-2表达下降或显著下降,而TRE1-5表达上升或显著上升,海藻糖合成酶(trealose-6-phosphate synthase, TPS)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、糖原合成酶(glycogen synthase, GS)基因的表达均显著下调。【结论】TRE2-like和TRE2基因表达被抑制后,异色瓢虫海藻糖等代谢受到影响。研究结果为探究异色瓢虫体内膜结合型海藻糖酶的潜在功能和调控机制奠定了基础。     

RNAi和取食不同品种水稻后白背飞虱多铜氧化酶4基因的表达差异及生物学效应

【目的】分析RNAi及取食不同品种水稻后白背飞虱Sogatella furcifera多铜氧化酶4(multicopper oxidase 4, MCO4)基因的表达差异和生物学效应,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】通过生物信息学技术方法分析白背飞虱MCO4基因的核苷酸和氨基酸序列;利用RNAi技术沉默白背飞虱3龄若虫的MCO4基因,检测显微注射法和饲喂法的沉默效率,研究该基因被干扰后对白背飞虱3龄若虫存活率的影响;白背飞虱成虫取食不同抗性水稻品种24 h后,采用RT-qPCR检测其体内MCO4基因表达量的变化,并统计其体重。【结果】白背飞虱MCO4基因的核苷酸序列全长为2 166 bp,编码721个氨基酸。显微注射法进行MCO4基因的RNAi可成功沉默白背飞虱的MCO4基因,且沉默效率远高于饲喂法。MCO4基因被RNAi沉默后白背飞虱3龄若虫存活率显著低于正常若虫的。与取食水稻感虫品种TN1相比,取食水稻抗虫品种IR26的成虫MCO4基因表达量显著增加,且成虫体重显著降低。【结论】显微注射法可以更好地干扰白背飞虱MC04基因的表达。沉默MCO4基因对白背飞虱3龄若虫的存活率有显著影响,我们推测MCO4基因在白背飞虱取食水稻中具有重要的作用。     

重金属镉胁迫对白纹伊蚊幼虫海藻糖代谢的影响

【目的】深入了解镉对白纹伊蚊Aedes albopictus的毒害作用机理和白纹伊蚊对极端环境的适应机制,揭示重金属胁迫对白纹伊蚊种群发生、疾病传播等可能存在的影响,为卫生害虫防控等提供参考依据。【方法】分别用200 mL配制好的50, 100, 200, 300和400 mg/L镉溶液对放置于320 mL一次性杯中长势一致的白纹伊蚊3龄末至4龄初幼虫急性染毒12 h,以双蒸水养殖幼虫作为对照。通过生化方法测定处理后12 h白纹伊蚊幼虫体内海藻糖、葡萄糖和总糖原含量以及可溶性海藻糖酶(TRE1)和膜结合型海藻糖酶(TRE2)活力,并采用qRT PCR测定这些幼虫体内海藻糖合成酶基因(TPS), TRE1和TRE2表达量。【结果】在200和300 mg/L重金属镉处理12 h时白纹伊蚊幼虫海藻糖含量显著增加,在高镉浓度(300和400mg/L)处理时葡萄糖含量显著下降,而不同镉浓度急性处理对总糖原含量没有影响。TRE1和TRE2活力在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降。300 mg/L镉处理组TPS相对表达量达到最高值,TRE1和TRE2相对表达量在高镉浓度(300和400 mg/L)处理时显著下降,与酶活力变化趋势表现一致。【结论】当镉浓度低于半致死浓度(217 mg/L)时,镉急性胁迫使白纹伊蚊幼虫TPS基因表达上调,而TRE基因则表达量下降,TRE活力降低,从而促使葡萄糖转化为海藻糖,通过海藻糖的积累来应对镉胁迫压力。这些结果说明海藻糖在白纹伊蚊在重金属应激中起一定作用,白纹伊蚊幼虫可以通过合成海藻糖从而提高应对镉胁迫的抗逆能力。     

草地贪夜蛾海藻糖合成酶基因的克隆、时空表达谱及对温度胁迫的响应

【目的】本研究旨在通过克隆草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase)基因SfTPS,分析其在草地贪夜蛾不同发育阶段、不同组织中的表达水平及不同温度胁迫时5龄幼虫中的相对表达量,为进一步探究TPS在草地贪夜蛾生长发育及抗逆应激反应中的功能奠定基础。【方法】运用RT-PCR技术克隆草地贪夜蛾SfTPS的全长编码区,并进行生物信息学分析。运用RT-qPCR技术检测SfTPS在草地贪夜蛾不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(体壁、中肠和脂肪体)中和经短期(2, 4和8 h)高(35℃)低温(10℃)胁迫后5龄幼虫中的表达变化。【结果】克隆获得2 571 bp的草地贪夜蛾TPS cDNA序列,命名为SfTPS(GenBank登录号： MT920672),全长开放阅读框(ORF)长2 481 bp,编码的826个氨基酸具有TPS和TPP两个保守结构域。同源比对和系统进化分析表明,昆虫TPS蛋白具有较高的保守性,SfTPS与斜纹夜蛾S. litura的TPS亲缘关系最近,序列一致性达到99.15%。SfTPS中α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲占比分别为38.14%, 12.23%和48.55%;SfTPS的三级结构为同源二聚体。RT-qPCR结果表明,SfTPS在草地贪夜蛾卵期和1-5龄幼虫期低表达,在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达,且草地贪夜蛾变态前后SfTPS的表达量变化较大。组织分布结果显示,SfTPS在5龄幼虫脂肪体中表达量最高。草地贪夜蛾5龄幼虫经2~8 h低温(10℃)和高温(35℃)胁迫后,SfTPS的相对表达量显著高于对照(25℃),分别为对照的4.43~9.34和2.50~6.03倍。【结论】SfTPS基因在草地贪夜蛾生长发育过程及抵御高低温度胁迫中可能具有重要作用。     

胰岛素受体基因InR调控褐飞虱海藻糖代谢研究

在昆虫中已发现成熟的典型胰岛素信号通路,但是其调控海藻糖代谢途径的机制还未清晰。为探讨胰岛素受体基因在褐飞虱海藻糖代谢平衡及其发育的调控作用,本文采用RNAi技术抑制胰岛素受体(InR)基因的表达,测定处理后海藻糖、糖原和葡萄糖含量及海藻糖酶活变化,并检测InR、类胰岛素多肽(Ilp)、海藻糖代谢途径中关键基因的表达。研究结果表明dsRNA注射后能够显著抑制Ilp和InR基因的表达;InR1低表达后72 h能够显著抑制3种糖类物质的含量;InR表达抑制后72 h可溶性海藻糖酶活性上升,而膜结合型海藻糖酶活性下降;当InR表达受抑制后3个海藻糖酶和2个海藻糖合成酶基因的表达都显著下降。这些结果说明InR能够影响海藻糖等糖类物质的平衡。从而为将来通过调控昆虫血糖平衡来控制害虫提供理论依据。     

赤拟谷盗TRE基因家族特性及RNAi抑制表达效果分析

分析赤拟谷盗海藻糖酶基因(Trehalase,简称TRE)家族的特性及RNAi介导的TRE基因沉默后的相互作用效果。采用生物信息学和相关软件分析5个海藻糖酶基因序列特征以及二级结构等分子特性并推测其生理功能,用MEGA 6.0软件构建TRE与其它昆虫TRE的系统进化树;采用注射RNAi技术,分别干扰赤拟谷盗海藻糖酶基因mRNA的表达;采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测单个海藻糖酶基因表达抑制后对其它TRE基因mRNA表达的影响。赤拟谷盗4个可溶性海藻糖酶TRE1蛋白相似性高,具有类似的二级结构,即含有相似比例的α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲,膜结合型海藻糖酶TRE2与TRE1在蛋白质的二级结构上差异较大;系统进化树分析表明赤拟谷盗的可溶性海藻糖酶与其它昆虫的TRE1聚集在一起,膜结合型海藻糖酶与其它昆虫的TRE2聚集在一起;RNAi实验结果表明单独干扰某个TRE1基因的mRNA表达后,其它3个TRE1基因的表达有的上升,有的下降,而TRE2基因表达都为显著下降;单独干扰TRE2基因表达,则其它4个TRE1基因的表达一致显著下降。赤拟谷盗可溶性TRE1和膜结合型TRE2的二级结构差异较大,单个TRE基因表达被抑制后,其他TRE基因存在连锁抑制或者互补功能。     

柑橘大实蝇滞育和非滞育蛹体内海藻糖含量的调控

【目的】通过比较柑橘大实蝇Bactrocera minax蛹滞育期与滞育前和滞育后以及滞育蛹与非滞育蛹体内海藻糖和葡萄糖含量的变化、海藻糖合成代谢途径中关键酶的活力变化以及关键酶基因的表达量变化,明确蛹滞育期间海藻糖合成代谢途径中关键酶对海藻糖含量的调控。【方法】利用分光光度法检测柑橘大实蝇滞育前(1日龄蛹)、滞育期(30,60和90日龄蛹)以及滞育后(120和150日龄蛹)蛹体内海藻糖与葡萄糖含量的变化,以及海藻糖合成代谢途径中的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)、海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)活力的变化;利用实时定量荧光PCR(qPCR)检测TPS,TPPB,TPPC-1,TPPC-2和Tre-1基因表达量的变化。向1日龄蛹体内注射20-羟基蜕皮酮(20E)作为处理(以注射10%乙醇为对照),分别于注射后1和30 d比较处理组与对照组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶活力以及上述基因表达量的差异。【结果】柑橘大实蝇蛹进入滞育后,海藻糖含量显著升高,葡萄糖含量无显著变化; TPS和TPP的酶活力以及TPS,TPPC-1和TPPC-2表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育期达到最高水平,维持至羽化前显著下降;TPPB表达量在整个蛹期无显著差异; Tre酶活力以及Tre-1表达量在化蛹后逐渐升高,于滞育早期达到最高水平,随后显著下降,羽化前再次显著上升。注射20E后1 d,与对照组相比,处理组蛹体内海藻糖与葡萄糖含量、关键酶(TPS,TPP和Tre)活力以及TPS,TPPC-2和Tre-1表达量无显著变化,TPPB表达量显著下降,TPPC-1表达量显著上升;注射后30 d,与对照组滞育蛹相比,处理组非滞育蛹海藻糖含量显著上升,葡萄糖含量、TPS和Tre酶活力、TPS和Tre-1表达量显著下降,TPP酶活力以及TPPB和TPPC-2表达量无显著差异。【结论】柑橘大实蝇蛹体内海藻糖的含量在合成代谢途径中关键酶的调控下,随着滞育状态发生变化,表明海藻糖与滞育之间存在密切的关系,但其作用机理仍待进一步研究。     

南方水稻黑条矮缩病对褐飞虱和白背飞虱体内三种保护酶活性的影响

为探寻植物感染病毒病后对刺吸性害虫体内生化酶活性的影响,本文研究了感染南方水稻矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的水稻对褐飞虱Nilaparvata lugens和白背飞虱Sogatella furcifera成虫及若虫体内三种保护酶活性的影响。结果表明,取食染病水稻的白背飞虱和褐飞虱成虫及若虫体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性均随取食时间的延长而增加。在带毒水稻上取食12 h后,白背飞虱成虫、褐飞虱成虫、若虫体内SOD活性与对照比差异不显著外,其他均显著高于对照;取食24 h后,白背飞虱若虫体内SOD、POD活性和褐飞虱若虫SOD活性虽高于对照但未达显著水平;取食5 d后,白背飞虱若虫、褐飞虱成虫、若虫POD活性未达显著外,其他均显著高于对照。以上研究结果可为进一步研究植物-病毒-寄主三种之间的关系提供参考。     

cycle基因对噻嗪酮、噻虫嗪防治白背飞虱效果影响探索研究

白背飞虱Sogatella furcifera是我国重要的迁飞性水稻害虫,长期以来,其防治手段主要是化学防治。大量使用化学农药易导致环境污染及害虫抗药性增加等,因此需要探索高效的农药使用方法。本研究在1 d内不同时间点用0.27 g/L噻虫嗪、5 mL/L噻嗪酮对白背飞虱的致死率进行检测,结果发现,7∶00时噻虫嗪、噻嗪酮浸染72 h后的校正死亡率均最低,分别为54%、13.9%;16∶00时噻虫嗪、噻嗪酮浸染72 h后的校正死亡率均最高,分别为89.8%、44.9%。定量结果表明节律基因Sfcycle在白背飞虱雌虫或雄虫的中肠表达量最高,4龄和5龄若虫期在蜕皮前表达量比蜕皮后高,成虫期表达量相对稳定。RNAi研究结果发现Sfcycle能够影响白背飞虱P450基因SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2的表达,用农药处理干涉后的白背飞虱死亡率都在7∶00、16∶00两个时间点都增高,且没有显著性差异,表明Sfcycle基因能够影响噻虫嗪、噻嗪酮对白背飞虱的防治效率。     

褐飞虱自噬相关基因NlATG13的表达与功能分析

【目的】自噬参与多种细胞生理过程,自噬相关蛋白ATG13是ATG1/13复合物的组成部分, 在启动自噬中发挥着重要作用。本研究旨在分析ATG13在褐飞虱Nilaparvata lugens中发挥的功能,评估其作为害虫防治靶标的潜力。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用RACE克隆褐飞虱NlATG13的cDNA全长序列;应用生物信息学技术分析NlATG13的核苷酸和氨基酸序列特征。利用RT-qPCR检测其在褐飞虱不同发育阶段(1-5龄若虫和雌雄成虫)和不同组织(5龄若虫头、胸、中肠和脂肪体以及刚羽化雌成虫的卵巢)中的表达模式。通过显微注射dsNlATG13至3龄若虫进行RNAi敲减NlATG13的表达,探究其对褐飞虱生存和中肠细胞自噬的影响;利用RT-qPCR检测RNAi 4 d时3龄若虫中糖原合成与代谢通路相关基因NlGSK3, NlGS和NlGP的表达量。【结果】克隆得到NlATG13的cDNA全长序列(GenBank登录号: MF805752),其开放阅读框长1 203 bp,编码一个含400个氨基酸的蛋白质(GenBank登录号: AWW05678.1)。系统发育分析表明,在纳入分析的物种中,NlATG13蛋白与半翅目温带臭虫Cimex lectularius和茶翅蝽Halyomorpha halys的ATG13蛋白进化关系较为接近。发育表达谱结果表明NlATG13在褐飞虱3和5龄若虫中的表达量显著高于在1-2龄若虫、雌成虫和雄成虫中的; 组织表达谱结果表明NlATG13在5龄若虫头部和脂肪体中的相对表达量较高,在胸部的表达量最低。RNAi结果显示,与dsGFP对照组相比dsNlATG13处理组中褐飞虱中肠细胞中存在明显的糖原颗粒积累,NlGS, NlGSK3和NlGP的表达量均无显著变化,组织ATP含量显著降低;褐飞虱的存活率显著降低,处理第10天时褐飞虱存活率下降到41.4%,而dsGFP对照组的存活率保持在85.6%的较高水平。【结论】 RNA干扰NlATG13基因对褐飞虱的生存和中肠细胞自噬具有显著的抑制效果,NlATG13基因具有作为褐飞虱防治靶标的潜力。     

德国小蠊两个海藻糖合成酶基因的克隆、组织分布及温度诱导表达分析

【目的】海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase, TPS）是参与昆虫血糖-海藻糖合成的关键酶。本研究旨在克隆德国小蠊 Blattella germanica TPS基因,研究TPS基因在德国小蠊不同组织中的表达模式及在不同温度处理下的表达情况。【方法】通过RACE技术克隆德国小蠊TPS基因全长序列,利用荧光定量PCR的方法检测TPS基因在德国小蠊5龄幼虫不同组织中的表达模式及在高温(40℃和46℃处理30 min)及低温(0℃和10℃处理1 h)逆境下的表达量变化。【结果】从德国小蠊中克隆获得2个TPS基因,分别命名为 BgTPS1 (GenBank登录号：KR050213) 和 BgTPS2 (GenBank登录号：KR050214)。其中,BgTPS1基因cDNA序列全长2 987 bp,开放阅读框 (ORF) 2 502 bp,编码833个氨基酸;BgTPS2基因cDNA序列全长3 212 bp,开放阅读框2 469 bp,编码822个氨基酸。BgTPS1和BgTPS2基因都主要在5龄幼虫脂肪体中表达,且BgTPS2基因的表达量为BgTPS1基因表达量的3.9倍。在两种不同极端温度诱导下,BgTPS1和BgTPS2基因mRNA均上调表达。其中,BgTPS2 的表达量始终显著高于 BgTPS1。在0℃时,BgTPS1和BgTPS2的表达量最高。【结论】德国小蠊5龄幼虫中存在2个TPS基因。两个TPS基因均在脂肪体中高表达,且BgTPS2基因的表达量显著高于BgTPS1基因;低温和高温诱导下均能促进两个基因的表达量上升。该结果为进一步明确昆虫海藻糖的合成途径及其在昆虫对温度逆境的反应中的作用研究奠定了基础。     

飞蝗可溶型海藻糖酶基因的序列分析及mRNA表达特性

海藻糖酶是海藻糖代谢过程中的一个关键酶, 在昆虫发育和能量调节中具有重要作用, 为进一步探讨海藻糖酶基因的功能, 本文分析了飞蝗Locusta migratoria一可溶型海藻糖酶基因的氨基酸序列并对其mRNA表达特性进行了研究。结果表明： 该海藻糖酶（TRE, GenBank登录号： FJ795020）不含有跨膜结构。系统进化树分析结果显示, 该酶与大豆蚜Aphis glycines、 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum、 褐飞虱Nilaparvata lugens和灰飞虱Laodelphax striatella可溶型海藻糖酶具有较近的亲缘关系, 因此我们将该酶的基因命名为LmTre-1。对该基因在不同组织和发育时期表达量的荧光定量 PCR 分析表明： LmTre-1在卵发育前期、 中期的表达量都很低, 卵发育后期表达量显著提高; LmTre-1在5龄若虫和成虫被检测的组织部位中均有表达, 在体壁中的表达量最高, 其次是在脂肪体、 肌肉、 气管、 精巢及卵巢中; 5龄飞蝗刚蜕皮后LmTre-1在体壁中的表达量较高, 随着生长发育其表达量逐渐降低; LmTre-1在成虫发育期体壁中稳定高表达。LmTre-1的mRNA表达特性与几丁质合成酶1基因非常相似, 据此推测该基因可能与体壁几丁质的合成相关。本研究为深入探讨该基因的生理功能提供了重要的基础数据, 并为以海藻糖酶为杀虫靶标的农药筛选奠定实验基础。     

稻虱红单节螯蜂寄生不同虫龄白背飞虱对二者发育表现的影响

【目的】为了解稻虱红单节螯蜂Haplogonatopus apicalis与白背飞虱Sogatella furcifera间的互作关系,开展了稻虱红单节螯蜂在白背飞虱不同龄期寄生时,对寄主及其自身发育表现影响的研究。【方法】在室内25℃条件下,观察了被寄生的白背飞虱各龄若虫及其寄生蜂稻虱红单节螯蜂的发育表现。【结果】白背飞虱2, 3, 4和5龄若虫被寄生后,当龄及其后各龄的历期均显著延长;2和3龄若虫被寄生后,成虫羽化率仅分别为54.29%和60.95%,显著低于在4和5龄若虫被寄生后的成虫羽化率（分别为96.20%和100%）。稻虱红单节螯蜂寄生白背飞虱5龄若虫后的发育历期（23.77 d）显著短于寄生2龄若虫后的发育历期（27.77 d）;寄生3龄若虫的成蜂羽化率最高,为56.19%;而寄生5龄若虫的羽化雄蜂比例最高,为77.12%。【结论】稻虱红单节螯蜂寄生可使白背飞虱若虫发育历期显著延长,白背飞虱2和3龄若虫是稻虱红单节螯蜂发育的适宜寄主。     

西花蓟马P450基因在继代适应菜豆植株中的应答反应

菜豆是西花蓟马的重要寄主,但西花蓟马对豆荚的嗜食性高于叶片。为探讨西花蓟马在适应菜豆植株过程中P450基因的应答反应,利用实时荧光定量PCR技术检测了西花蓟马从菜豆豆荚转换到菜豆植株后F 1、F 2和F 3三个世代2龄若虫和成虫体内9个P450基因相对表达量的变化。结果表明,西花蓟马2龄若虫体内CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3和CYP6-4的表达量在转换到菜豆植株后F 1代显著升高,然后下降;而CYP4-4和CYP6-2的表达量到F 3代才显著上升;CYP6-1的表达量只有在F 2代显著下降,仅为对照的42.21%,其余世代下和对照均无显著差异;CYP4-5和CYP6-3的表达量在不同世代均显著低于对照。对于成虫而言,CYP4-4、CYP4-5和CYP6-4的表达量在转换到菜豆植株F 1后显著上升,分别是对照的2.28倍、1.40倍和1.31倍;CYP6-1、CYP6-2、CYP6-3的表达量在F 1代开始下降,而CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3的表达量在F 2代才开始下降。在同一个世代下,西花蓟马2龄若虫与成虫体内P450基因表达量不完全相同,除CYP4-2的表达量在F 1和F 3代,以及CYP4-4、CYP4-5和CYP6-3的表达量在F 1代两个虫态间差异不显著外,其余情况下均是2龄若虫的表达量高于成虫的。结果说明西花蓟马通过调节P450基因适应菜豆植株,其表达量与其取食的世代和虫态相关。     

三种杀虫剂对褐飞虱海藻糖含量和海藻糖酶活性的影响

为了解农药处理导致褐飞虱Nilaparvata lugens (Stål）飞行能力增强的生理机制, 本文采用蒽酮法和酶促反应终止法, 研究了吡虫啉、 三唑磷和溴氰菊酯3种杀虫剂亚致死剂量对褐飞虱3龄、 5龄若虫及长、 短翅型雌雄成虫体内海藻糖含量和海藻糖酶活性的影响。结果表明： 杀虫剂处理的褐飞虱3龄若虫海藻糖含量和海藻糖酶活性与对照相比没有显著差异（P>0.05）。40 mg/L三唑磷处理的褐飞虱5龄若虫体内海藻糖含量显著低于对照（P<0.05）, 比对照降低了24%; 而20和40 mg/L三唑磷处理的褐飞虱5龄若虫海藻糖酶活性显著高于对照（P<0.05）, 分别比对照高出了100%和129%。10 mg/L吡虫啉, 20 和40 mg/L三唑磷以及3和6 mg/L溴氰菊酯处理的褐飞虱短翅雌成虫和雄成虫体内海藻糖含量显著低于对照（P<0.05）, 雌成虫体内海藻糖含量比对照分别降低了36%, 53%, 67%, 58%和69%, 雄成虫体内海藻糖含量比对照分别降低了59%, 71%, 65%, 70%和77%; 而40 mg/L三唑磷以及3和6 mg/L溴氰菊酯处理的褐飞虱短翅型雌成虫和雄成虫体内海藻糖酶活性显著高于对照（P<0.05）, 雌成虫体内海藻糖酶活性比对照分别高出了124%, 100%和88%, 雄成虫体内海藻糖酶活性比对照分别高出了146%, 132%和118%。10 mg/L吡虫啉, 40 mg/L三唑磷和3 mg/L溴氰菊酯处理的褐飞虱长翅型雌成虫和雄成虫海藻糖含量显著低于对照（P<0.05）, 雌成虫海藻糖含量比对照分别降低了44%, 34%和37%, 雄成虫体内海藻糖含量比对照降低了48%, 54%和43%; 而5和10 mg/L吡虫啉处理的长翅型雌成虫和雄成虫海藻糖酶活性显著高于对照（P<0.05）, 雌成虫体内海藻糖酶活性比对照分别高出了317%和300%, 雄成虫体内海藻糖酶活性比对照分别高出了170%和97%。这些结果说明这3种杀虫剂亚致死剂量处理可以增强褐飞虱体内海藻糖酶活性, 并导致海藻糖含量下降。本研究结果对深入阐明农药诱导褐飞虱再猖獗及杀虫剂处理增强其飞行能力的生理机制具有一定的科学价值。     

飞蝗Knickkopf家族基因表达对蜕皮激素的响应

【目的】研究飞蝗LocustamigratoriaKnickkopf(Knk)家族基因mRNA表达对蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）的响应情况,丰富飞蝗Knk家族基因功能研究,为飞蝗表皮发育相关基因的转录调控研究奠定基础。【方法】采用RT-qPCR方法,对LmKnk家族4个基因在飞蝗不同发育天数（5龄若虫第1天到成虫第3天）的表皮中的表达特性进行分析;向飞蝗体腔注射20E,分析LmKnk家族4个基因表达的变化情况;采用RNAi技术干扰20E受体基因LmEcR,分析LmKnk家族基因的表达变化情况。【结果】通过RT-qPCR检测,发现LmKnk在飞蝗5龄第1天至成虫第3天不同发育天数的表皮中均衡表达,而LmKnk2,LmKnk3-FL及LmKnk3-5'基因均在蜕皮前表达量逐渐升高,蜕皮后迅速降低。向飞蝗体腔注射20E后,发现飞蝗Knickkopf家族4个基因对20E均有应答,但响应时间点有差异,LmKnk和LmKnk2的表达量分别在注射20E 3 h和6 h后开始升高,而LmKnk3-FL和LmKnk3-5'的表达量在注射20E12h后开始上升。飞蝗5龄第1天若虫注射ds LmEcR后,发现Knickkopf家族4个基因表达均下调。【结论】飞蝗Knickkopf家族基因的表达受20E调控,是20E的下游应答基因。     

褐飞虱过氧化物酶基因NlPOD1的克隆、鉴定及功能分析

【目的】探明褐飞虱Nilaparvata lugens过氧化物酶基因NlPOD1的分子特性、表达模式和生物学功能。【方法】基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆获得NlPOD1基因全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其序列特征;通过qRT-PCR技术检测NlPOD1在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(头部、脂肪体、血淋巴和肠道)中的表达水平,以及不同微生物(大肠杆菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae)（1×10⁷/mL）注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术沉默褐飞虱 5 龄若虫NlPOD1基因,并通过生物测定分析NlPOD1基因沉默和接种金龟子绿僵菌(1×108/mL)后褐飞虱的存活率及致死中时(LT₅₀)。【结果】获得褐飞虱NlPOD1全长 cDNA 序列(GenBank登录号: MZ682107),其开放阅读框长2 049 bp,编码682个氨基酸,含有一个典型的动物亚铁血红素过氧化物酶结构域(An_peroxidasedomain),且N端包含一段由29个氨基酸残基组成的信号肽。系统发育分析表明,NlPOD1与半翅目其他昆虫的POD亲缘关系较近,其中与茶翅蝽Halyomorpha halys POD亲缘关系最近。发育表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱不同发育阶段均有表达,其中卵期表达量最低,5龄若虫中表达量最高;组织表达谱结果表明,NlPOD1在褐飞虱5龄若虫不同组织中均有表达,且肠道和血淋巴中的表达量显著高于头部和脂肪体中的;微生物诱导表达模式表明,与注射PBS的对照组相比,大肠杆菌诱导48 h内各时间点NlPOD1在褐飞虱5龄若虫中的表达量显著上调,而在金黄色葡萄球菌和金龟子绿僵菌诱导下,NlPOD1表达量均呈现先上调后回稳的态势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlPOD1可显著抑制NlPOD1的表达水平。通过RNAi抑制NlPOD1表达后褐飞虱5龄若虫存活率不变,但注射dsNlPOD1联合金龟子绿僵菌感染对褐飞虱5龄若虫的LT₅₀(4.5 d)显著低于注射dsGFP联合金龟子绿僵菌感染的对照组的LT₅₀(5.4 d),说明沉默NlPOD1后褐飞虱对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。【结论】NlPOD1在褐飞虱病原防御过程中发挥重要作用,可作为开发RNAi和病原真菌联合介导的褐飞虱防治技术中的一个潜在靶标。     

辛硫磷、灭多威和dsRNA饲喂对棉铃虫ace基因表达的影响

乙酰胆碱酯酶(ACh E)是有机磷与氨基甲酸酯类杀虫剂的作用靶标,以棉铃虫体内乙酰胆碱酯酶为对象,通过检测辛硫磷、灭多威两类农药处理和饲喂ace ds RNA表达菌对乙酰胆碱酯酶基因(ace1、ace2)转录活性的影响,为阐明棉铃虫化学防治及基于RNAi的防治提供一定的参考。实验采用实时荧光定量PCR方法,分析辛硫磷、灭多威对棉铃虫4龄幼虫诱导12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后ace基因的转录水平,利用表达ds RNA的菌液喂食2龄棉铃虫进行RNAi后检测ace基因的沉默效果。结果显示:灭多威和辛硫磷处理后,在12 h时,ace1和ace2皆显著下调,其后,ace1表达下调而ace2上调;RNAi处理后,棉铃虫ace1、ace2基因表达量在24 h、48 h下调明显,随后表达量略有上调。推测农药处理使棉铃虫幼虫生理代谢破坏造成ace1、ace2表达降低,随后ace1基因表达持续下降,而ace2表达逐渐升高,这可能与补偿农药对Ach E酶活性的抑制有关;RNAi处理使棉铃虫生长发育受到不同程度的抑制,ace1和ace2基因都出现明显的表达抑制。以上结果为以乙酰胆碱酯酶及其编码基因为靶标的棉铃虫防治提供了参考。     

取食施硅水稻后白背飞虱体内解毒酶和保护酶活性的变化

为探究取食施硅水稻后白背飞虱Sogatella furcifera体内解毒酶（羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)）和保护酶（超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)）活性的变化。以感虫品种TN1为供试水稻品种,采用营养液添加硅酸钠（Na2SiO3·9H2O）的方法设置施硅（Si+, 112 mg Si/L）和不施硅（Si-, 0 mg Si/L）处理,测定取食Si+或Si-水稻24 h、48 h、72 h和96 h后白背飞虱成虫体内CarE、GST、MFO、SOD、CAT和POD活性的动态变化。结果显示,与取食Si-水稻的白背飞虱相比,取食Si+水稻48 h、72 h和96 h时,CarE活性显著降低,GST活性显著升高;取食72 h和96 h时,MFO活性显著上升。取食Si+水稻24 h和48 h时,SOD和CAT活性显著增大;取食72 h时,SOD和POD活性显著增高;取食96 h时,3种保护酶活性均降低,其中SOD和POD活性显著降低。以上结果表明,施硅可能通过影响白背飞虱体内解毒酶和保护酶活性的动态平衡,进而对白背飞虱生理代谢造成影响。本研究为合理利用硅肥防治白背飞虱提供了理论依据。     

小菜蛾保幼激素受体基因PxMet-1和PxMet-2的分子特性、表达模式与功能分析

【目的】本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella保幼激素受体基因Met的分子特性与表达模式,分析其生殖调控作用,为筛选有效控制小菜蛾的新靶标奠定基础。【方法】根据本课题组已有的小菜蛾基因组数据库,采用PCR技术克隆小菜蛾两个Met基因的cDNA全长序列;利用qPCR测定其在小菜蛾不同发育阶段及成虫不同组织中的表达模式;基于RNAi解析其在小菜蛾雌成虫生殖发育中的作用。【结果】克隆获得小菜蛾PxMet-1(GenBank登录号: MK697672)与PxMet-2(GenBank登录号: MK697673)的cDNA序列,开放阅读框(ORF)全长分别为1 575和2 100 bp,预计分别编码524和699个氨基酸,理论分子质量分别为60.5和70.7 kD,预测等电点分别为6.73和5.50。PxMet-1和PxMet-2都具有4个保守结构域,即1个helix-loop-helix结构域(bHLH)、2个PAS保守结构域及1个PAC保守基序。系统发育树分析表明,小菜蛾PxMet-1和PxMet-2聚为不同的两支,但两者均与鳞翅目昆虫Met聚在一起。表达模式分析表明,小菜蛾PxMet 1与PxMet-2在蛹期(化蛹后1-3 d)与雌成虫期(羽化后0-72 h)均有表达;PxMet-1的表达量在蛹期(化蛹后1-3 d)无明显差异,但均显著高于雌成虫期(羽化后0-48 h),在羽化后72 h达到高峰;而PxMet-2在雌成虫期(羽化后0-48 h)的表达量呈先上升后下降的趋势,在羽化后12 h出现表达高峰,且成虫期(羽化后0-36 h)的表达量显著高于蛹期。PxMet-1与PxMet-2在成虫脂肪体中的表达量显著高于其他组织。注射PxMet-1+PxMet-2 dsRNA 24 h后,小菜蛾PxMet-1与PxMet-2的表达量均受到显著抑制;同时干扰PxMet-1和PxMet-2后,小菜蛾成熟卵子数目显著减少,羽化后3 d内单雌产卵量显著下降。【结论】抑制Met基因表达能够显著降低小菜蛾雌虫的卵子形成与产卵量。本研究为探索保幼激素的生殖调控机理奠定了基础,在实践上有助于筛选小菜蛾种群遗传调控的潜在靶标。