多巴胺神经通路及其对蜜蜂行为的影响

蜜蜂复杂的社会行为受到了研究者的广泛关注,了解蜜蜂的学习、记忆、导航、信息传递等行为的神经分子基础,可对探索人类自身的脑科学和复杂社会行为的分子基础提供比较研究信息。本文综述了多巴胺的作用机制及其在蜜蜂行为中的作用,详细介绍了蜜蜂脑部的多巴胺受体,总结了蜜蜂脑部多巴胺水平的影响因子等,最后对进一步研究多巴胺神经通路对蜜蜂行为的作用及机制的前景做一展望。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂工蜂嗅觉学习行为的影响及其脑部转录组分析

[目的]分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响,为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据.[方法]实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50％蔗糖溶液,以饲喂不合吡虫啉的50％蔗糖溶液为对照,通过伸吻反应(proboscis ex...     

昆虫多巴胺及其受体的研究进展

多巴胺（dopamine, DA）是脊椎动物和无脊椎动物体内一种重要的生物胺, 其参与调控了昆虫的多种生理反应和行为过程, 如学习与记忆、 认知、 性取向、 抉择、 运动以及型变等。多巴胺主要通过结合特异性的G蛋白偶联受体, 即多巴胺受体（dopamine receptors, DARs）来发挥生理作用。本文综述了多巴胺在昆虫中的调控、 分布及所参与的生理功能, 如多巴胺调控昆虫的交配、 发育、 嗅觉以及运动行为等, 特别对DARs的信号转导、 生理功能以及药理学等方面进行了详细评述。昆虫的DARs大致可分为两大类： D1-like DARs和D2-like DARs。D1-like DARs包含有2种亚型, 分别为DOP1和DOP2。DOP1仅能偶联胞内cAMP的上升, 而DOP2不仅可以起胞内cAMP的上升, 还可偶联胞内Ca²⁺的释放。 D2-like DARs仅包含有1种亚型DOP3, 其被激活后引起胞内cAMP的降低。DA通过激活不同的DARs可偶联不同的第二信使系统, 所产生的下游细胞反应则与昆虫的各种行为相关, 而对昆虫DARs的药理学研究将有助于我们开发特异性的杀虫剂用于害虫防治。     

LC-MS/MS检测癫痫患者神经递质类氨基酸

目的：建立液相色谱串联质谱同位素内标法检测神经递质类氨基酸并用于癫痫患者临床评价。方法：选用AAA-C18柱色谱柱,以乙腈水（含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸）为流动相,采用梯度洗脱进行分离,血浆样品用iTRAQ-115衍生化试剂处理后,加入iTRAQ-114衍生化的氨基酸内标并进样,选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测（MRM）扫描方式进行检测。疾病组与健康组的统计采用t检验和主成份分析。结果：疾病组和健康组氨基酸测定结果显示：Trp、GABA两组间没有显著性差异（P〉0.05）,Arg、Gly、Ser、Tau、Asp、Glu、EtN、两组间有显著性差异（P〈0.05）,通过PCA分析显示,疾病组与健康组之间差异明显,Asp、Glu、Ser等是引起差异的主要氨基酸。结论：试验方法灵敏、专属性强,并初步的用于癫痫患者体内氨基酸评价。     

LC-MS/MS 检测癫痫患者神经递质类氨基酸

目的:建立液相色谱串联质谱同位素内标法检测神经递质类氨基酸并用于癫痫患者临床评价.方法:选用AAA-C18柱色谱柱,以乙腈水(含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸)为流动相,采用梯度洗脱进行分离,血浆样品用iTRAQ-115衍生化试剂处理后,加入iTRAQ-114衍生化的氨基酸内标并进样,选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行检测.疾病组与健康组的统计采用t检验和主成份分析.结果:疾病组和健康组氨基酸测定结果显示:Trp、GABA两组间没有显著性差异(P＞0.05),Arg、Glv、Ser、Tau、Asp、Glu、EtN、两组间有显著性差异(P＜0.05),通过PCA分析显示,疾病组与健康组之间差异明显,Asp、Glu、Ser等是引起差异的主要氨基酸.结论:试验方法灵敏、专属性强,并初步的用于癫痫患者体内氨基酸评价.     

意大利蜜蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达微小RNA及其靶基因分析

【目的】蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis(简称球囊菌)是一种特异性侵染蜜蜂幼虫肠道的致死性真菌病原。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种在转录后水平对m RNA进行负调控的关键调控因子。本研究旨在对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称意蜂)幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的差异表达mi RNAs(DEmiRNAs)及其靶基因进行深入分析,为揭示DEmiRNAs在胁迫应答中的作用提供重要信息。【方法】利用small RNA-seq(s RNA-seq)技术对正常及球囊菌侵染的意蜂6日龄幼虫肠道(分别表示为Am CK和Am T)进行测序,通过相关生物信息学软件对DEmiRNAs进行预测和分析。利用TargetFinder软件预测DEmiRNAs的靶基因,然后利用Blast软件对靶基因进行GO和KEGG数据库的功能注释。通过Cytoscape软件构建DEmiRNAs与其靶m RNAs的调控网络。通过茎环实时荧光定量PCR(stem-loop RT-qPCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Am CK和Am T的测序分别得到9 230 496和10 823 667条有效序列标签; Am CK vs Am T比较组中包含15个上调和6个下调mi RNAs,分别结合3 503和3 252个靶基因,它们可分别注释到40和39个GO terms以及104和99条代谢通路;进一步分析发现调控网络中的17个DEmiRNAs靶向结合116个与丝氨酸蛋白酶相关的m RNAs,14个DEmiRNAs靶向结合54个与泛素介导的蛋白水解相关的m RNAs。Stem-loop RT-qPCR验证结果显示随机选择的4个DEmiRNAs (mi R-251-x,mi R-9277-y,mi R-1672-x和mi R-4968-y)的表达量变化趋势与测序结果一致,表明测序数据真实可信。【结论】本研究率先对意蜂幼虫肠道在球囊菌胁迫后期的DEmiRNAs及其靶基因进行预测与分析,提供了mi RNAs的表达谱和差异表达信息。ame-miR-927b,mi R-429-y和mi R-8440-y等DEmiRNAs可能参与对丝氨酸蛋白酶的调控和对泛素介导的蛋白水解的调控,DEmiRNAs与靶基因之间存在复杂的调控网络关系。DEmiRNAs可参与到意蜂幼虫肠道与球囊菌间的互作。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程的nce-miR-23928及其靶基因表达谱

【背景】东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)专性侵染成年蜜蜂中肠上皮细胞而导致的微孢子虫病给养蜂业造成严重损失。【目的】检测东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-23928及其靶基因在侵染意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)工蜂过程的表达谱,为深入探究nce-miR-23928在东方蜜蜂微孢子虫侵染中的功能及调控机制提供依据。【方法】通过RNAhybrid、miRanda和TargetScan软件预测nce-miR-23928的靶基因。使用BLAST工具将上述靶基因比对到基因本体论(geneontology,GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)、Nr和Swiss-Prot数据库以获得相应注释。采用实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR,RT-qPCR)技术检测nce-miR-23928及其靶基因在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的相对表达量。【结果】相较于接种后1 d (1 day post infection, 1 dpi),nce-...     

意大利蜜蜂甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2的cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR技术克隆了意大利蜜蜂(Apis mellifera)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因amGAPDH2,利用MEGA5.1、DNAMAN、PredictProtein和I-TASSER等软件对该基因进化关系以及其所对应的蛋白的同源性、理化性质和结构进行了预测和分析。从意大利蜜蜂cDNA文库中克隆得到了长1188 bp的amGAPDH2序列,GenBank登录号为MH152402。该序列具有完整的开放阅读框(ORF,114~1115 bp),其编码333个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫的GAPDH有较高的序列相似性(80%以上),系统进化分析表明amGAPDH2与中华蜜蜂、小蜜蜂的序列相似性最高。利用ProtParam等软件对amGAPDH2编码的蛋白质分析结果显示,amGAPDH2属于不稳定、亲水性蛋白;二级结构属于混合型,Helix占25.53%、Strand占24.62%、Loop占49.85%;am GAPDH2具有两个保守结构域:一个是N端的NAD(P)结合结构域,另一个是C端的催化结构域Gp_dh_C。该研究为后期amGAPDH2基因的生理功能研究提供了理论依据。     

西方蜜蜂磁受体基因AmMagR的克隆及表达分析

本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera磁受体基因AmMagR的序列,并分析该基因在工蜂不同日龄、不同组织中的表达特征,以期为该基因的功能研究提供理论基础。以西方蜜蜂工蜂为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR技术克隆西方蜜蜂MagR基因的序列;利用多种生物信息学软件对其核酸及氨基酸序列分析;采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析在西方蜜蜂工蜂不同日龄(1日龄、5日龄和21日龄)和不同组织(头部、胸部和腹部)中MagR基因的相对表达量。克隆到西方蜜蜂MagR基因,并命名为AmMagR(GenBank登录号:MH635411),其序列长度为748 bp,编码区长390 bp,编码130个氨基酸,其蛋白质分子量为14.142 kDa,理论等电点为9.06,无信号肽,无跨膜结构,且在第24～126位氨基酸之间得到一个结构域Fe-S_biosyn。系统发育树显示,西方蜜蜂AmMagR与小蜜蜂Apis florae AfIscA(IscA别称MagR)、中华蜜蜂Apis cerana cerana AcIscA基因聚成一支。荧光定量PCR结果表明,AmMagR基因在西方蜜蜂不同日龄的工蜂头部、胸部和腹部均有表达。5日龄工蜂的相对表达量最高,5日龄工蜂头部和胸部的AmMagR基因表达量显著高于1日龄(P0.05)和21日龄(P0.05),腹部AmMagR基因表达量显著高于21日龄(P0.05),但与1日龄的比较差异不显著(P0.05)。1日龄、5日龄和21日龄工蜂胸部的AmMagR基因表达量均显著高于头部和腹部(P0.05);1日龄工蜂头部AmMagR基因表达量均高于腹部(P0.05),但5日龄和21日龄工蜂AmMagR基因在头部与腹部的表达量无显著差异(P0.05)。明确了该基因在西方蜜蜂工蜂不同日龄和不同组织中的表达模式,并推测AmMagR可能参与了西方蜜蜂的定位、归巢过程。     

意大利蜜蜂amPGAM2基因的克隆、序列特征及表达分析

【目的】磷酸甘油酸变位酶(PGAM)是糖酵解和葡萄糖异生途径中一种发挥重要作用的蛋白酶,本研究拟明确amPGAM2基因的序列特征及表达模式。【方法】以意大利蜜蜂Apismellifera为研究对象,克隆了amPGAM2基因的cDNA序列,分析了其序列特征及其在工蜂、雄蜂、蜂王的不同发育时期的表达模式。【结果】序列特征分析表明,克隆所得序列全长976 bp,包含1个完整的开放阅读框,共编码254个氨基酸。该基因核苷酸序列与中华蜜蜂Apiscerana(98.4%)高度相似,并存在15个潜在抗原表位、9个磷酸化位点和5个组氨酸磷酸酶域活性部位,属于组氨酸磷酸酶超家族,是一种二磷酸甘油酸依赖性的可溶中性稳定蛋白。荧光定量PCR结果表明,amPGAM2基因在不同品级、不同发育时期的表达差异显著(P0.05)。工蜂卵期3日龄、幼虫期5日龄表达最高,雄蜂成虫期表达最高,蜂王幼虫期4日龄表达最高,且工蜂、雄蜂及蜂王由卵孵化成幼虫阶段和由红眼蛹羽化至成虫阶段,其表达都呈上升趋势。【结论】本研究结果推测amPGAM2基因在卵的孵化及精卵发生过程中具有重要作用,为进一步认识意大利蜜蜂生殖发育过程中的能量代谢提供理论基础。     

意大利蜜蜂不同日龄工蜂脑部三种miRNA的表达水平

【目的】意大利蜜蜂 Apis mellifera ligustica（简称“意蜂”）是社会性昆虫,蜂群中的工蜂表现出年龄依赖性的行为转变,其行为转变的机制一直是研究的热点。本研究分别检测了3种miRNA（ame-let-7, ame-miR-13b和ame-miR-279）在不同日龄意蜂工蜂脑部的表达情况,以期为探究意蜂工蜂年龄依赖性行为变化机制提供重要线索。【方法】通过荧光定量PCR分别检测了不同发育时期（4, 8, 12, 17, 22, 26和30日龄）意蜂工蜂脑部3种miRNA的表达情况,并检验miRNA的表达差异情况。【结果】ame-let-7的表达量随工蜂日龄的增加逐渐降低,在17日龄后其表达量趋于稳定;ame-miR-13b的表达量则随着工蜂日龄的增加逐渐增加,但在26和30日龄的工蜂中稳定表达;ame-miR-279的表达量则呈类似正态分布状态,其中在12日龄工蜂中表达量最高,且在17日龄后稳定表达。这3种miRNA表达均具有明显的时间特异性。【结论】 ame-let-7, ame-miR-13b和ame-miR-279的表达与工蜂年龄依赖性行为变化具有相关性和规律性,对于深入探究miRNA的作用位点具有重要参考价值。     

中华蜜蜂气味受体基因AcOr170的克隆与序列分析

本研究采用自行设计的引物对中华蜜蜂Apis cerana cerana雄蜂触角中气味受体基因(Odorant receptors 170)Ac Or170的c DNA序列进行了克隆和序列分析,以探寻中华蜜蜂雄蜂气味受体Ac Or170基因在近缘种昆虫间的进化差异。结果表明:中华蜜蜂雄蜂气味受体基因Ac Or170的c DNA序列总长度为1356 bp,编码区序列长度为1188 bp,共编码396个氨基酸,其分子量为46.272 k Da,等电点8.96,Genbank登录号:KX264359。结构域的分析结果显示,该蛋白具有7tm-6一个保守结构域。经序列比对后发现,Or170的序列在中华蜜蜂、西方蜜蜂和大蜜蜂间的亲缘性很近。     

中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1 RNA最佳干扰片段的筛选

为了更好地筛选出中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1有效干扰序列,本研究以中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1为靶标,分别选取3个片段AcerOr1-1（429 bp）、AcerOr1-2（218 bp）和AcerOr1-3（543 bp）,并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后通过单只饲喂进行体内RNAi实验,运用qPCR和Western从mRNA水平和蛋白水平检测干扰效率。实验结果显示：片段大小429 bp组dsAcerOr1-1和对照组mRNA表达量之间不具有显著的统计学差异（P＞0.05）,片段大小为218 bp的dsAcerOr1-2组和片段大小为543 bp的dsAcerOr1-3组对AcerOr1表达量都有显著的抑制（P＜0.05）,抑制率分别为88.85%±0.12%和69.16%±1.06%,以片段大小为218 bp的dsAcerOr1-2干扰效果最佳。Western blot结果显示：与mRNA表达水平检测结果一致,饲喂dsAcerOr1-1 AcerOr1蛋白的表达量与对照组差异不显著（P＞0.05）,而饲喂dsAcerOr1-2和dsAcerOr1-3后AcerOr1蛋白的表达量均受到显著抑制（P＜0.05）。本试验成功构建AcerOr1基因干扰载体,最终确定218 bp的dsAcerOr1-2为最佳干扰片段,证实其能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因的体内外功能奠定了基础。     

意大利蜜蜂哺育蜂学习记忆相关基因的转录组学分析

【目的】筛选与意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica哺育蜂学习记忆密切相关的基因。【方法】在人工组建意大利蜜蜂蜂群中收集10日龄哺育蜂、21日龄哺育蜂、21日龄采集蜂,通过喙伸反应(proboscis extension reflex, PER)实验测定这3组样本之间学习记忆能力的差异。利用RNA-seq技术对具有学习能力和不具有学习能力的10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂脑中基因表达量进行全面分析,筛选出与哺育蜂学习记忆密切相关的差异表达基因(DEGs),并对这些差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。qPCR检测随机选取的3个DEGs(上调基因TpnCⅢa和MED23以及下调基因Pkc)在具有学习能力和不具有学习能力的10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂脑中的表达量。【结果】PER实验结果显示,经过5次训练后,意大利蜜蜂21日龄哺育蜂的学习能力显著高于10日龄哺育蜂的,而21日龄哺育蜂和21日龄采集蜂的学习能力无显著差异;同样地,21日龄哺育蜂的记忆能力显著高于10日龄哺育蜂的,而21日龄哺育蜂和21日龄采集蜂的记忆能力无显著差异。RNA-seq分析筛选到88个与哺育蜂学...     

大豆Harosoy近等基因系低聚糖及其组分含量的变异分析

以高效液相色谱技术检测在北京和内蒙古种植的供试材料Harosoy近等基因系的低聚糖及其组分含量,考查Harosoy近等基因系的低聚糖含量的变异和不同地点材料的低聚糖及其组分含量相互间的相关性,低聚糖及其组分含量分别与蛋白质、脂肪含量间的相关性。研究结果表明,内蒙古种植材料低聚糖含量的平均值均高于北京种植的材料,说明内蒙古的条件有利于大豆的低聚糖形成和贮存。北京和内蒙古的材料蔗糖含量分布范围分别是3.3%~6.5%、3.9%~6.9%,棉籽糖分布范围分别是0.6%~1.4%、0.7%~1.1%,水苏糖分布范围分别是2.7%~3.7%、2.8%~3.8%,大豆低聚糖分布范围分别是6.9%~10.9%、7.8%~11.3%。同时发现,两地种植材料的低聚糖含量间和蔗糖含量间均具有显著负相关性,蔗糖含量间r=-0.7810,低聚糖含量间r=-0.7355;低聚糖及其组分含量与蛋白质、脂肪含量间均无相关性(P0.05)。还发现了低聚糖及其组分含量在两地稳定表达的材料共10个。     

意大利蜜蜂幼虫肠道内球囊菌及其纯培养的高表达基因差异分析

【背景】球囊菌是一种典型的蜜蜂真菌性病原,特异性地侵染蜜蜂幼虫。目前,有关球囊菌在侵染过程中的基因表达规律的信息极为有限。【目的】通过深入分析胁迫意大利蜜蜂(意蜂)幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的高表达基因(HEGs)差异,探索球囊菌在胁迫意蜂幼虫肠道后期与胁迫前的基因表达规律。【方法】利用RNA-Seq技术对球囊菌胁迫的意蜂6日龄幼虫肠道(Aam T)及球囊菌纯培养(AaCK)进行深度测序,根据FPKM值筛选得到球囊菌的HEGs,进而通过GO(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析、Venn分析对上述HEGs进行功能预测和生物学意义挖掘。【结果】AaCK与Aam T的转录组测序共得到105 447 578条原始读段(Raw reads),经过滤得到88 466 344条有效读段(Clean reads),两端平均Q20为97.50%,平均Q30为93.81%。GO富集分析结果显示,AaCK的HEGs富集于26个GO terms,基因富集数最多的是细胞(22 Unigenes),其次是细胞组件(22 Unigenes)和代谢过程(21 Unigenes);Aam T的HEGs富集于22个GO terms,基因富集数最多的是催化活性(23 Unigenes),其次是细胞进程(18 Unigenes)和代谢过程(18 Unigenes)。KEGG代谢通路(Pathway)富集分析显示,AaCK的HEGs富集在109个Pathways上,基因富集数最多的是核糖体(179 Unigenes),其次是氨基酸生物合成(70Unigenes)和碳代谢(62 Unigenes);Aam T的HEGs富集在114个Pathways上,基因富集数量最多的是核糖体(178 Unigenes),其次是碳代谢(116 Unigenes)和氧化磷酸化(112 Unigenes)。Venn分析结果显示,AaCK与Aam T共有的HEGs有260个,二者特有的HEGs分别为2 161个和4 445个。【结论】提供了胁迫意蜂6日龄幼虫肠道的球囊菌及其纯培养的HEGs表达谱,揭示了球囊菌在胁迫前和胁迫后期的基因表达规律,也为阐明球囊菌致病的分子机理提供了有益的信息和线索。     

东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂过程中nce-miR-12220及其靶基因的表达谱

东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae侵染成年蜜蜂导致蜜蜂微孢子虫病。本研究旨在验证东方蜜蜂微孢子虫nce-miR-12220的存在和表达,并检测nce-miR-12220及其靶基因在病原侵染意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica (简称意蜂)工蜂过程的表达谱。Stem-loop RT-PCR和Sanger测序结果显示nce-miR-12220真实存在和表达。靶向预测结果显示nce-miR-12220共靶向KRAB-A和γ tubulin等15个基因。上述靶基因可注释到19个GO条目和3条KEGG通路。RT-qPCR结果显示,相较于接种后1 d (1 day post infection,1 dpi),nce-miR-12220在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。类似地,与1 dpi相比,靶基因KRAB-A在2 dpi上调表达,而在3-12 dpi阶段总体呈下调表达的趋势。另外,与1 dpi相比,靶基因γ tubulin在2-12 dpi阶段总体表现出显著下调表达的趋势。上述结果表明nce-miR-12220与KRAB-A和γ tubulin之间存在潜在的靶向结合和正向调控关系;东方蜜蜂微孢子虫通过下调表达nce-miR-12220抑制KRAB-A的表达进而促进增殖;意蜂工蜂可能通过抑制东方蜜蜂微孢子虫的γ tubulin表达抵御病原侵染。研究结果明确了nce-miR-12220及其靶基因KRAB-A和γ tubulin在东方蜜蜂微孢子虫侵染意蜂工蜂过程中的动态表达规律,为深入探究nce-miR-12220在病原侵染中的功能及调控机制提供了理论和实验依据。     

意大利蜜蜂amPFK基因的克隆与表达分析

[目的]本研究旨在明确意大利蜜蜂磷酸果糖激酶(amPFK)基因的序列特征及表达模式,为进一步研究amPFK在生殖和发育中的功能奠定理论基础.[方法]采用RT-PCR技术克隆了amPFK基因,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行了分析;通过RT-qPCR检测了amPFK基因在意大利蜜蜂不同品级不同发育时期的表达模式.[结果]克...     

意大利蜜蜂幼虫肠道的miRNAs的生物信息学预测及分析

【目的】蜜蜂肠道是食物消化和营养吸收的主要部位,同时也是抵御病原侵染的重要场所。本研究旨在对意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(简称意蜂)幼虫肠道的microRNAs(miRNAs)及其靶基因进行深入分析,进而解析miRNAs在幼虫肠道发育和生长过程中的作用。【方法】利用small RNA-seq(sRNA-seq)技术对意蜂4、5和6日龄幼虫肠道进行测序,通过相关生物信息学软件对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测及分析。利用TargetFinder软件预测miRNAs的靶基因,然后将靶基因通过BLAST软件进行GO和KEGG数据库的功能注释。利用Cytoscape软件构建miRNAs与其靶向结合的mRNAs的调控网络。【结果】意蜂幼虫肠道样品的测序共获得96 329 456条有效标签序列(Clean tags),预测出560个miRNAs,包括45个novelmiRNAs。上述miRNAs的长度主要分布在17-27nt之间,且不同长度的miRNAs的首位碱基偏向性具有明显差异。表达量聚类分析结果显示,331个miRNAs为4、5和6日龄幼虫肠道所共有且表达量较为稳定,随着发育时间延长,特有miRNAs的表达水平呈总体增加的趋势。利用TargetFinder软件共预测出16479个意蜂幼虫肠道的靶基因,其中有8132和3361个可分别注释到GO和KEGG数据库,进一步分析发现有224个靶基因注释在Wnt信号通路,分别有2个和27个靶基因与保幼激素和蜕皮激素的调控密切相关。【结论】本研究在全基因组水平对意蜂幼虫肠道的miRNAs进行预测和分析,研究结果不仅丰富了意蜂的miRNAs信息,也为深入研究意蜂幼虫肠道的生长发育机理打下了初步基础。     

意大利蜜蜂工蜂幼虫nkd基因的生物信息学分析及功能研究

【目的】意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,简称意蜂)是西方蜜蜂(Apis mellifera)的亚种之一。蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)侵染意蜂幼虫导致白垩病。本研究对西方蜜蜂裸表皮蛋白(naked cuticle, Nkd)进行保守基序预测和系统进化分析,并通过RNAi明确nkd基因对意蜂工蜂幼虫体重及宿主响应蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答的影响,以期丰富西方蜜蜂基因nkd的信息,并揭示意蜂幼虫nkd的功能。【方法】通过MEME软件预测西方蜜蜂和其他9个物种Nkd蛋白的保守基序。采用MEGA X软件对西方蜜蜂及其他9个物种的Nkd蛋白进行系统进化分析。通过饲喂dsRNA对意蜂幼虫肠道内的nkd进行RNAi。使用电子天平对幼虫进行称重。利用RT-qPCR检测nkd基因的干扰效率及免疫基因的相对表达量。【结果】西方蜜蜂与东方蜜蜂、柑橘凤蝶、家蚕和金凤蝶的Nkd蛋白均含有3个保守基序(motif 1、motif 2 和motif 3),说明上述5个昆虫物种的Nkd具有较高的保守性。西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白聚为一支,说明二者的亲缘关系近。与dsRNA-egfp组相比,dsRNA-nkd组5日龄和6日龄幼虫肠道内nkd的表达量均极显著下调(P<0.001),干扰效率分别为49.60%和56.40%。另外,dsRNA-nkd组幼虫体重较dsRNA-egfp组显著下降,说明nkd显著影响幼虫体重。RT-qPCR结果显示,4日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2均被激活表达;5日龄幼虫肠道内abaecin、apidaecin、birc5和defensin-1均被激活表达,PGRP-S2的表达受到抑制;6日龄幼虫肠道内abaecin被激活表达,而apidaecin、birc5、defensin-1和PGRP-S2的表达均受到抑制,说明上述5个免疫基因在宿主响应胁迫的过程中呈不同的表达趋势,均参与宿主的免疫应答,nkd与abaecin和apidaecin的表达存在负向调控关系。【结论】西方蜜蜂的Nkd蛋白含有3个保守基序(motif 1、motif 2和motif 3),西方蜜蜂与东方蜜蜂的Nkd蛋白亲缘关系最近,通过饲喂dsRNA能有效干扰意蜂工蜂幼虫肠道内nkd表达,nkd影响意蜂工蜂幼虫体重及宿主对蜜蜂球囊菌胁迫的免疫应答。