重组枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的纯化和性质研究

大肠杆菌中表达的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶(5-aminolevulinate dehydratase, ALAD),其N端含有组氨酸标签,Ni-NTA 一步纯化至均一.纯化的酶比活为3.6 U/mg蛋白,酶的最适pH为8.0～10.0,Km为0.95 mmol,Vmax为16.7 mmol/h,在55 ℃温浴10 min,酶活保留85 %,2 mmol/L的K+、Zn2+、Mg2+、Li+、Fe3+和Mn2+提高酶活,2 mmol/L的Co2+和Ca2+对酶活没有显著影响,2 mmol/L的Cu2+和1 mmol/L的Hg2+完全抑制酶活.在2 mmol/L的EDTA存在下酶活性丧失,表明酶催化依赖金属离子.100 mmol/L的酮戊酸抑制酶活约50 %.10 mmol/L的2-巯基乙醇时提高酶活3倍,而100 mmol/L的二硫苏糖醇几乎完全抑制酶活.氨基酸修饰表明赖氨酸和半胱氨酸残基可能是酶催化必需的,组氨酸和丝氨酸残基对酶催化不起关键作用.     

一种pH稳定的黄色漆酶的快速纯化和性质特征

通过丙酮沉淀和 DEAE- cellulose DE52 柱层析, 快速、有效地从一株白腐菌 Trametes sp. SQ01 的发酵液中纯化了漆酶。纯化的漆酶并非传统漆酶那样呈现蓝色, 而是一种黄色蛋白。以 ABTS 为底物时, 该酶的最适 pH 和温度分别是 pH 4.5 和 70°C, Km 为 0.029 mmol/L。T. SQ01 漆酶在 pH 3.0~11.0时, 酶活相对稳定, 在 pH 5.0 时最为稳定, 是目前报道的 pH 稳定性最好的漆酶。低浓度的金属离子(1 mmol/L) Cu2+、Mg2+ 、Ca2+ 和Co2+ 对漆酶有促进作用, 而高浓度(5 mmol/L)的Co2+、Zn2+、 Mn2+、Mg2+ 却抑制漆酶酶活。SDS 对该酶有激活作用, 当其浓度为1 mmol/L时, 漆酶相对酶活达到128%。DTT对漆酶强烈抑制, 即使是浓度为1 mmol/L, 亦可完全抑制漆酶酶活。纯化后的漆酶对亮蓝(RBBR) (100 mg/L)的脱色能力显著, 0.5 U/mL 的漆酶在 10 min内即可达到 80%的脱色率。T. sp. SQ01 漆酶的快速纯化以及高效脱色的能力表明该酶在染料脱色降解方面有着广阔的应用前景。     

碳源对重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的影响

研究了在好氧培养基中分别添加不同碳源对两阶段发酵菌体生长、酶活及代谢产物分布的影响,结果表明添加4mmol/L葡萄糖和12,54,80mmol/L乙酸钠均可以提高好氧阶段的菌体密度和相关酶活。将不同条件下培养的菌体转接厌氧发酵后,厌氧阶段的酶活和代谢产物分布也发生改变。进一步对酶活及代谢产物分析表明：Escherichia coli NZN111(sfcA)厌氧发酵过程中,磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)是产丁二酸的关键酶,丙酮酸激酶(PYK)主要和副产物丙酮酸的积累有关,异柠檬酸裂解酶(ICL)对丁二酸产量也有一定影响。好氧培养基中添加80mmol/L乙酸钠,厌氧发酵结束时丁二酸的质量收率可达89.0%,相比对照提高了16.6%。     

液化沙雷氏菌磷脂酶A1的克隆表达及乳糖自诱导发酵

为了利用大肠杆菌高效生产重组磷脂酶,克隆了液化沙雷氏菌磷脂酶A1的编码基因pla,分别使用pET-28a(+)和pET-20b(+)载体,实现了磷脂酶A1在大肠杆菌BL21(DE3)中的功能表达.重组菌利用载体pET-28a(+)在原始信号肽的介导下胞外PLA1酶活达40.8 U/mL,占总酶活的91％.重组菌转接至优化后的发酵诱导培养基:蛋白胨10 g/L,酵母粉5g/L,葡萄糖0.8 g/L,乳糖5 g/L,25 mmol/L Na2HPO4,25 mmol/L KH2PO4和1 mmol/L MgSO4;菌体生长6h后,添加7.5 g/L的甘氨酸,37℃恒温发酵24 h,重组菌胞外PLA1酶活达到128.7 U/mL.     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶的诱导、提纯和性质

在YEPD培养基中添加NaCl,可以诱导酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞内3-磷酸甘油脱氢酶的形成,当NaCl浓度达5％时,酶比活从0.05U/mg提高0.5U/mg;若再限制培养墓中葡萄糖浓度在100mg/L以下,酶比活可达到0.89U/mg。酶比活与培养基中的NaCl浓度的函数关系式为:Sa=0.129C~3-0.038C~2+0.034C+0.063(0≤C≤5％)。粗酶液经Sephadex G-25凝胶过滤,Blue Sepharose亲和层析以及Mono Q离子交换等步骤,提纯123.6倍,得纯酶液。经SDS-凝胶电泳测得分子量为45000±2000。酶的最适温度为51℃,最适pH值为6.8。保温30分钟的半失活温度(t_(1/2))为41℃。NADH和DHAP的Km(mmol/L)值分别为:0.017和0.134。     

液态发酵条件下拟康宁木霉8985产纤维素酶能力初探

液态发酵条件下,以微晶纤维素为唯一碳源,比较了拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis 8985和里氏木霉T.reesei QM9414产纤维素酶的能力。8985发酵12 h开始产生纤维素酶,36 h时酶活达到产酶峰值的50%,此时QM9414尚未诱导产酶。测定8985发酵84 h时上清液中滤纸纤维素酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶的酶活分别为1.06、3.62、1.80和6.67 IU/mL,分别是QM9414上述酶活的1.72、1.70、6.35和1.12倍。8985滤纸纤维素酶酶活的最适反应条件为pH 4.5,反应温度50℃,在Fe³⁺(≤4 mmol/L)和Cu²⁺(0–10 mmol/L)存在条件下酶活稳定。     

纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

首先将来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶基因CsCEm进行密码子优化,然后进行全基因合成,再将其引入到载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-CsCEm并转化入毕赤酵母GS115,得到酵母工程菌株.经微孔板筛选、摇瓶筛选得到酶活最高的重组工程茵GS115-4-19.该菌株经甲醇诱导144 h后,摇瓶发酵液上清酶活达到0.42 U/mL.酶学性质研究结果表明:该酶的最适pH为7.5,且在pH 6.0 ～8.0范围内相对酶活都在80％以上;在pH 4～9的缓冲液中放置24 h后仍保持原酶活力的80％以上;最适温度为80℃,在60℃～80℃保温30 min后,相对酶活在80％以上.动力学研究结果表明该酶对底物乳糖的Km和Vmax分别为(120.27±9.96) mmol/L和(1.035±0.05) mmol/L/min.纤维二糖差向异构酶在毕赤酵母中的成功表达为生物酶法合成乳果糖提供了重要参考.     

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB8中天冬氨酸转氨酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

为获得具有热稳定性的天冬氨酸转氨酶,从极端嗜热细菌Thermus thermophilus HB8中克隆得到天冬氨酸转氨酶基因aspC,并在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行表达,发现在Rosetta(DE3)中具有较高的表达量。重组酶的最适反应pH是7.0,37℃下在pH8～10的缓冲液中保温1h酶活几乎不改变。重组酶反应的最适温度为75℃,酶活稳定的温度范围为25～55℃。重组酶在65℃时半衰期为3.5h,75℃时为2.5h。重组酶的KmKG为7.559mmol/L,VmaxKG为0.086mmol/(L·min),KmAsp为2.031mmol/L,VmaxAsp为0·024mmol/(L·min)。Ca2 、Fe3 、Mn2 等金属离子对酶活性有微弱抑制作用。     

外源添加代谢中间产物对米根霉生产富马酸的影响

通过外源添加代谢中间产物(苹果酸、草酰乙酸和丙酮酸),研究其对米根霉积累富马酸及代谢关键酶的影响。结果表明,添加4.0 g/L苹果酸时,富马酸质量浓度可达34.0 g/L,与对照相比提高了24.5%,同时提高富马酸酶(FUMR)比酶活,抑制乙醇脱氢酶(ADH)比酶活。添加少于1.0 g/L草酰乙酸可提高FUMR比酶活,降低ADH比酶活,促进富马酸积累;但添加高于1.0 g/L草酰乙酸抑制了FUMR和ADH比酶活,导致富马酸和乙醇产量下降。添加1.5 g/L丙酮酸,使富马酸的质量浓度从27.3 g/L增加到38.7 g/L,提高了41.8%,但FUMR比酶活下降34.7%,而ADH比酶活保持稳定。     

羊红细胞超氧化物歧化酶的研究

自羊红细胞分离得到一种高等电点的铜.锌-超氧化物歧化酶(Cu.ZnSOD)。其沉降系数(S)为3.23,亚基分子量为16600,等电点为8.50,紫外最大吸收峰位于259nm,酶分子中含有铜和锌,氨基酸组成特点与其它动物来源的Cu.Zn-SOD相同。该酶的比活性为5500U/mg(黄嘌吟氧化酶—细胞色素还原法);对KCN的抑制作用敏感,最适pH值为6。     

Phosphoenolpyruvate Phosphatase Activity and Partial Properties in Rice Leaves

Phosphoenolpyruvate (PEP) specific phosphatase was isolated from rice (Oryza sativa) leaves. Its Km (PEP) was 0. 42 mmol/L. The partially purified PEP phosphatase showed a narrow pH profile and had an optimum pH of 8.7. It was relatively stable at the pH ranging from 6.2 to 9.5 and at temperature below 40℃. Pi showed no effect on the enzyme activity at low concentrations, but slight inhibitory effect at the concentrations above 5 mmol/L. The enzyme activity was activated by Mgz+ and inhibited by CaCl2, CoCl2, CuSO4, FeSO4 and ZnSO4.     

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的组成型表达、产物纯化及鉴定

将大肠杆菌(E.coli K12) S 腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因克隆至质粒pBR322中,获得的重组质粒pBR322-SAMS转入大肠杆菌JM109菌株,构建了能高效组成型表达SAMS的重组菌E.coli JM109 (pBR322-SAMS)。将重组大肠杆菌破碎后上清液经20%~40%硫酸铵分级盐析、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析,即可得到纯度提高5倍,比活为48.7 μ/mg的SAMS,三步纯化的总回收率为62%,纯度达到92%。SAMS表达量为1 176μ/L,占到菌体可溶性总蛋白的20%。重组酶的最适反应pH为8.5,4℃下在pH 7.5的缓冲液中保温10h酶活性几乎不改变。重组酶反应的最适温度为55℃ ,酶活性稳定的温度范围为20~35℃。重组酶的KmL Met为0.22mmol/L,Vmax L-Met为1.07mmol/(L·h),Km ATP为0.52 mmol/L,Vmax ATP为1.05 mmol/( L·h)。     

类产碱假单胞菌谷氨酸脱氢酶的提纯、鉴定及某些特性的初步研究

从类产碱假单胞菌纯化出电泳纯的谷氨酸脱氢酶,用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为２９０ ｋＤ,亚基分子量为４７ ｋＤ,提示该酶为六聚体．该酶对ＮＡＤＰ（Ｈ）和底物均具有高度专一性,对谷氨酸、α－酮戊二酸及ＮＡＤＰ＋ 的Ｋｍ 值分别为：２８ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ、１．２ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ及０．０６３ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．用Ｈｉｌｌ作图法求得酶对ＮＨ＋４ 和ＮＡＤＰＨ 的［Ｓ］０．５分别为２４ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ和０．０３７ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ．最适反应温度为５０℃,催化氨化反应和脱氨反应的最适ｐＨ 分别为８．０和８．８,在热稳定性方面不及嗜热细菌的谷氨酸脱氢酶稳定．提纯的谷氨酸脱氢酶在低温（４℃）条件下,可在Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中贮存半年以上,活力无明显下降,冷冻则可导致纯酶液迅速失活．氮源对菌体谷氨酸脱氢酶水平有显著影响．     

荞麦与大豆叶片乙醇酸氧化酶的纯化和性质比较研究

分别从荞麦与大豆叶片中部分纯化了乙醇酸氧化酶 (GO ,EC1 .1 .3 .1 ) ,并研究其部分性质。结果显示荞麦与大豆叶片中GO的催化特性有明显差异 :大豆叶片中GO对乙醇酸Km值为 0 .3 1mmol/L ,对乙醛酸Km值为 1 .98mmol/L。外源草酸对GO氧化乙醇酸活性影响很小 ,但对其氧化乙醛酸活性抑制明显 ,5mmol/L草酸可抑制 44%。而荞麦叶片中GO性质有所不同 :GO对乙醇酸Km为 0 .46mmol/L ,对乙醛酸Km为 0 .85mmol/L。草酸对荞麦GO氧化乙醇酸活性影响也很小 ,对其氧化乙醛酸活性的抑制作用明显小于大豆 ,5mmol/L草酸只抑制 2 4%。上述研究结果表明 ,荞麦GO对乙醛酸的亲和力明显强于大豆 ,并且草酸对其GO氧化乙醛酸活性影响较小。因此相对于大豆而言 ,GO可能在荞麦叶片草酸合成中起重要作用。     

The Role of Bivalent Cations on the Isolation of Allantoinase from the Soybean Seed Extracts

Allantoinases (ALNase) in the water extracts distilled from seeds and leaves of soybean (Glycine max L. cv. Keyu 10) were. remarkably heat stable. However the enzyme and non-enzyme protein in the seed extract, but not leaf extract, lost their activity and were denaturated at 75℃ for 5 min in the presence of Ca2+, Mg2+. or Mn2+ions respecitively. At room temperature over 40%～50% of the non-enzyme proteins in the seed extract could be removed by the bivalent cations without affecting the enzyme activity. This effect was weakend by the increase of concentration. Both extracts had different responses to all sorts of insoluble Ca2. salts. For the seed extract about 50 % of the non-enzyme proteins were removed by 5 % CaSO4 (W/V), without effecting the enzyme activity, while the leaf extract was sensible to Ca3 (PO4) 2. After treatment with 5 % Ca3 (PO4) 2 about 50 % of the enzyme activities and about 70% of proteins were lost. Mn2+ ions could enhance the enzyme activity in crude seed extract, but had no effect on partially purified enzyme from seeds and enzyme in crude extract from leaves. Further, EDTA had no effect on enzyme activity in both extracts.     

游离及固定化果糖基转移酶部分酶学性质的比较研究

 从诱变、筛选的米曲霉GX0 0 10菌株所产生的果糖基转移酶 ,经过纯化和固定化操作分别制备游离酶和固定化酶 ,对两者的酶学性质进行了比较研究 .结果表明 ,两者在蔗糖转化为蔗果低聚糖的酶促反应中 ,最适pH为 5 5,在pH5 0～ 7 5之间酶活性相对稳定 .游离酶和固定化酶的适宜温度范围分别是 4 5～ 52℃和 4 0～ 55℃ .在 55℃保温 60min ,酶活性保存率分别是 61 6%和 87 5% .固定化酶的热稳定性提高 .0 1mmol LHg2 +和 1mmol LAg+能完全抑制游离酶的活性 ,但只能部分抑制固定化酶的活性 ,1mmol L的Ti2 +能完全抑制两者的活性 .以蔗糖为底物时 ,游离酶的米氏常数Km=2 15mmol L ,而固定化酶Km =386mmol L .游离酶只能使用一次 ,固定化酶反复使用 54次后 ,剩余活力为 55 2 % .用 55% (W V)蔗糖溶液与固定化酶在pH5 0 ,4 6℃下作用 12h ,可获得61 5% (总低聚糖 总糖 )产物 ,其中蔗果五糖含量达到 7 2 % .     

Study on the Binding State of Calcium in Photosystem ⅡOxygen-Evolution Complex

Washing spinach PSII oxygen-evolution complex (OEC) with 2 mmol/L EGTA or extraction medium caused a 28.4% and 25.0% loss of oxygen evolution activities respectively, but the loss of polypeptide components of OEC did not take place, whereas washing with 1 mol/L NaCI caused both a 90.0% loss of oxygen evolution activity and loss of 17, 23kD polypeptides. Adding 5–10 mmol/L CaC12 could restore oxygen evolution activities of OEC by various washing to a great extent, but had no effect on control OEC, whereas adding 5–10 mmol/L EGTA had no effect on the OEC by various' washing, but caused the loss of oxygen evolution mixtures, which could induce the release of of 17, 23kD polypeptides from OEC, caused 54.3% loss of oxygen evolution activity, under this circumstance, adding 2 mmol/L of EGTA could only maintain a weak oxygen evolution activity of OEC, but adding 10 mmol/L of CaCl2 could restore oxygen evolution activity of OEC to the control level. These findings' suggest a two way loose binding of Ga2+ to PSⅡ OEC in one way Ca2+ is loose bound to the surface of PSⅡOEC and in other, the Ca2+-binding site is wrapped by 17, 23kD polypeptides. Both of them have effect on oxygen evolution activity of PSⅡ OEC. By way, Mn2+ can antagonize the restoration of oxygen evolution activity by Ca2+ to the NaCl-washing PSⅡ OEC.     

豇豆初生叶多胺氧化酶的催化特性

从豇豆幼苗 (6d苗龄 )初生叶提纯得到的多胺氧化酶 (EC 1 .4.3 .6 )属于二胺氧化酶 ,最有效的底物是 1 ,4 二胺丁烷 (腐胺 )、1 ,5 二胺戊烷 (尸胺 )、1 ,6 二胺己烷、1 ,1 0 二胺癸烷等α 二胺 ,其催化活性随二胺类底物碳链的增长而相应减弱。豇豆多胺氧化酶对亚精胺和精胺也具有较高的催化活性。另外 ,底物腐胺和尸胺的浓度超过 2mmol/L或亚精胺和精胺浓度超过 3mmol/L时会对酶活性有抑制效应。以腐胺和尸胺为底物时 ,酶的最适 pH约为7.0 ,而以亚精胺和精胺为底物时其最适pH为 6 .5。该酶的催化活性还随反应介质的离子强度增加而降低。K ,Ca2 和Mg2 (皆为 1 0mmol/L)对酶活性无明显抑制作用 ,而同样浓度的Mn2 ,Zn2 ,Fe2 ,Co2 和Cd2 则对酶活性有不同程度的抑制作用。金属螯合剂EDTA(1 0mmol/L)和腺苷蛋氨酸脱羧酶抑制剂甲基乙二醛 双脒腙 (0 .1mmol/L)可抑制酶活性约 80 % ,而铜结合剂KCN(1 .0mmol/L)、羰基试剂羟胺 (0 .1mmol/L)和氨基胍 (0 .1mmol/L)可导致该酶完全失活     

Aspartate aminotransferase ofLactobacillus murinus

Aspartate aminotransferase from Lactobacillus murinus is thermostable, its activity being not changed for two months at temperatures between 4 and -70 degrees C. Maximum activity was observed at 40 degrees C and pH 7.3 in phosphate buffer (30 mmol/L). delta G* Value of 26.3 kJ/mol was calculated from the Arrhenius plot. The Km values for L-aspartate and 2-oxoglutarate at pH 7.3 were 25 and 100 mmol/L, respectively. Sodium maleate and glutamate acted as inhibitors of the enzyme activity. The Ki values for sodium maleate with L-aspartate of 2-oxoglutarate as variable substrates were 1.1 and 0.5 mmol/L, respectively. The Ki values for glutamate with L-aspartate or 2-oxoglutarate were 8.0 and 4.0 mmol/L, respectively. An inhibitory effect was observed with 1 mM Hg2+ ions (1 mmol/L). The activity of the enzyme was diminished by only 12% in the absence of pyridoxal 5'-phosphate.