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应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:根据烟曲霉Mtol基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法.方法:通过对多种病原曲霉Mtol基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证.结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08 X 10-6μg/ml的模板DNA.结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题. 相似文献
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滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用 总被引:2,自引:0,他引:2
滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测10^3拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。 相似文献
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用辣根过氧化物酶标记DNA的技术,制备了酶标基因探针。研究了酶标过程和产物的电泳行为;用斑点杂交和southern印迹杂交探测了单链、双链DNA,灵敏度可达pg水平,以此酶标的Y染色体特异的DNA片段作探针,进行了DNA杂交的性别分析,证明该探针能清楚地区别两性基因组DNA,这对基因的研究和诊断有一定实用价值。 相似文献
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采用碱性磷酸酶标记DNA制备分子探针, 并首次在植物中应用。酶在苯醌作用下与单链DNA联结, 形成DNA和酶的共价复合物即酶标探针。此探针通过分子杂交与待测DNA结合, 再与酶的底物作用显色, 3~6h 内可观察结果。用此探针检测转基因植物中的UidA基因, 点杂交和Southern杂交结果表明, 所合成的酶标探针具有快速、准确、安全而经济的优点。点杂交证明外源UidA基因被成功转化到受体植物中, Southern 杂交对转基因的材料检测的结果证明, 该材料包含多个外源UidA基因拷贝, 初步确定其外源UidA基因拷贝数在5个以上。 相似文献
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PCR技术已成为核酸研究和临床实验室获取特异性基因序列的基本工具。随着它在基因诊断领域中的广泛应用,传统上用凝胶电泳分析PCR扩增产物的手段,已难以满是这一技术快速、敏感、特异的检测要求。近年来,许多以固相亲和检测为基础的非凝胶方法相继问世,但这些方法由于是通过固相表面的亲和介质与变性的单链PCR产物结合,再与标记探针杂交来实现检测,变性后扩增产物互补链的复性会由于竞争大大削弱检测探针的敏感性。本文介绍的单链尾引物技术,以一种在PCR引物中安置非扩增性单链尾的独特 相似文献
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<正> 核酸探针实质上是DNA或RNA片段,这类片段或参与某种功能或具有某种特征,并往往被连上放射性物质或非放射性物质的指示剂。探针的作用是探查目的DNA或RNA的存在情况,核酸双链分子中各碱基之间有严格的配对原则,就DNA分子说,碱基间的配对总是A-T,C-G,探针的单链只有和与之相对应的称为互补的单链在一起时才能形成新的双链分子,在一个被探测的体系中如果显示 相似文献
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一、前言 所谓DNA探针是指能识别特异碱基序列(基因)的有标记的一小段单链DNA分子,即是一段与被测定的核苷酸序列(靶序列),互补的带标记的单股脱氧核糖核苷酸。 相似文献
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植物病毒可以按其遗传物质的不同分为四大类,即双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒。其中单链RNA病毒又可以按基因RNA复制和表达方式的不同而分为正链RNA病毒和负链RNA病毒两种,大约70%的植物病毒属于正链RNA病毒。越来越多的实验证据表明,植物病毒,尤其是植物正链RNA病毒,具有某些不同于其它生命形式的特性,这些特性主要表现在基因结构、表达和调节等方 相似文献
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为构建小鼠噬菌体抗体库 ,以获得对人血纤维蛋白特异的抗体 ,由小鼠脾脏提取 m RNA,经反转录 PCR扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段 ,将二者和一段编码十五肽 (Gly4 Ser) 3的 DNA接头借助重组 PCR组装成为单链抗体 (single- chain antibody,Sc Ab)基因 .将单链抗体基因插入噬菌体展示载体 p CANTAB- 5E,通过电击法转化大肠杆菌 TG1细胞 ,用辅助噬菌体 M1 3K0 7超感染 ,构建了库容量在 1 0 8以上的噬菌体单链抗体库 .利用亲和选择方法 (淘选 ) ,从噬菌体抗体库中选得血纤维蛋白特异的单链抗体 .模拟抗体成熟过程 ,用 DNA改组 (DNA shuffling)技术使抗体基因重新组合 ,构建新的改组抗体库 ,并从中选择到提高了亲和力的噬菌体单链抗体 .抗体基因在大肠杆菌中表达 ,表达蛋白经 Sephadex G- 75柱层析分离 ,得到初步纯化的单链抗体蛋白 . 相似文献
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<正>引言 利用DNA探针做传染病的临床诊断在科学文献的许多报告中已有描述。DNA探针方法学的应用首先是为了获得特异性抗菌素抗性基因传播的资料以及作为研究其发展关系的工具,而不是检测抗微生物抗性。然而DNA探针主要优点之一是它能够用于检出微生物特异性基因而不需要先行分离与生长。由于这一技术能在病人原始标本中直接测定传 相似文献
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多聚酶链反应(PCR)是近几年发展起来的先进的快速体外基因扩增技术,它是以待扩增的两条DNA(或RNA)链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸引物介导,通过DNA聚合酶酶促反应,快速体外扩增特异DNA序列,并具有操作简便、快速、特异和灵敏的特点,已在很短的时间里迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、疾病诊断等各个领域,本文仅就在疾病诊断中的应用作一介绍。 相似文献
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脱氧核酶及其应用进展 总被引:1,自引:0,他引:1
脱氧核酶是利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段,具有高效的催化活性和结构识别能力,迄今为止,已发现大量具有催化功能的脱氧核酶。其中具有RNA切割活性的脱氧核酶,能催化RNA特定部位的切割反应,从mRNA水平对基因灭活.从而调控蛋白质的表达.可能成为治疗肿瘤、病毒感染性疾病以及其它相关疾病,基因功能研究,核酸突变分析等的新型工具。 相似文献
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采用DNase消化法从大鼠肝染色质分离得到富有转录活性的DNA(sDNA)。sDNA琼脂糖凝胶电泳,在0.5—6Kb范围内背景有一片荧光,小于1Kb范围内,出现明显区带。sDNA为探针与大鼠正常肝核RNA杂交百分数(29.5%),为以总核DNA为探针杂交百分数(8.2%)的3.6倍,并高于sDNA与大鼠肝癌核RNA杂交百分数(16.4%). 相似文献
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目的:建立目视化纳米探针检测宫颈癌组织HPV16E6基因的方法,为临床降低HPV感染者宫颈癌的发病率提供技术支持。方法:采用固定于硅烷化片基上的捕获探针,特异性结合单链人乳头瘤病毒16型新疆株E6基因(HPV16E6)扩增片断,再与互补的纳米金颗粒标记的探针结合,通过银染加强显色。结果:初步建立了金标银染法快速检测HPV16E6 DNA的技术。结论:金标银染法灵敏,可以快速特异地检测出各类宫颈组织中人乳头瘤病毒的感染,为进一步应用于临床检测降低新疆维吾尔妇女宫颈癌的发病率奠定了基础。 相似文献
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人工合成的单链DNA分子经PCR扩增形成双链DNA分子。将RecA蛋白与生物素标记的寡聚核酸探针序列在ATPγS存在的情况下共同哺育,使RecA蛋白包裹寡聚核酸探针,然后加入含同源序列的上述双链DNA分子经适当环境哺育形成了稳定的局部三链核酸结构。通过加入链亲和素包裹的磁珠吸附生物素化的探针,这样同源双链DNA分子与寡聚核酸探针形成的局部三链核酸结构也被吸附在磁珠上。使用磁分离装置提取这一结构,逐步降低盐离子浓度以洗脱双链DNA分子。将洗脱液中残留的蛋白质去除,经PCR扩增可获得目的DNA序列。同时使用同源探针和非同源探针在其它序列中提取目的DNA序列,结果显示目的DNA序列只被同源探针提取。实验结果显示了这一三链核酸结构形成的序列特异性,并且其稳定性随盐离子浓度降低而下降。提示在这一结构中同源的寡聚核酸单链与双链DNA分子形成了氢键结合,同时提示使用文中描述的方法可以提取特异的序列,用以克隆相应的基因。 相似文献
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棉花曲叶病毒大基因间区启动子在宿主植物中的表达活性 总被引:1,自引:0,他引:1
棉花曲叶病毒(CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ.为了研究其基因组大基因间区(LIR)的功能,以CLCuV侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增LIR并插入克隆载体.将LIR分别以互补链及病毒链基因转录方向与gus报告基因和nos终止子融合,构建了植物表达载体.通过农杆菌介导的方法转化烟草并测定转化植株的GUS活性,实验结果表明,LIR在互补链基因方向具有强启动子活性,GUS平均活性是CaMV 35S启动子的5~6倍,单株最高的GUS活性达到CaMV 35S启动子的10倍;组织化学定位证实其在叶肉及维管组织均有活性.LIR在病毒链基因方向的启动子活性较低.报道了CLCuV来源的分离的LIR在互补链基因方向可作为一种新型的强启动子元件应用于植物遗传操作. 相似文献