人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

结缔组织生长因子小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的：构建结缔组织生长因子（CTGF）基因的小干扰RNA（siRNA）,并检测其对CTGF基因表达的干扰效果。方法：根据CTGF基因序列,设计2条合理的CTGF-siRNA,并将其克隆到siRNA载体pSliencer2．1-U6neo中,转化大肠杆菌DH5a,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建成功的CTGF-siRNA重组质粒与带nJAG标签的CTGF表达载体共同转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果：构建了2个CTGFpsiRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的干扰效果可达75％以上。结论：构建的CTGF-siRNA可为进一步研究CTGF的功能提供参考。     

Sp1基因RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建干扰载体pSilencer3.1-Sp1,并初步研究其对Sp1基因的干扰作用。方法：根据Sp1cDNA编码序列,设计并合成针对Sp1基因的特异性RNA干扰片段,并将其克隆入pSilencer3.1-H1neo干扰载体中,构建Sp1基因小干扰RNA（siRNA）真核表达载体pSilencer3.1-Sp1;分别将阴性对照载体pSilencer3.1与重组载体pSilencer3.1-Sp1经脂质体LipofectAMINE2000介导转染HeLa细胞,采用RT-PCR、Western blot方法分别检测Sp1基因的转录与表达水平。结果：构建了Sp1基因siRNA真核表达载体pSilencer3.1-Sp1,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,并在mRNA水平和蛋白水平证实了载体的干扰效果。结论：特异性siRNA能明显抑制Sp1基因在HeLa细胞中的表达,为进一步研究Sp1的生物学功能和作用机制奠定了实验基础。     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。     

p300基因小干扰RNA慢病毒载体的构建及其对乳腺癌ZR75-1细胞的影响

目的:构建p300基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒表达载体,检测其对p300蛋白表达的干扰,以及对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术设计并合成针对p300基因的siRNA,并将其克隆到siRNA表达载体pSIH-H1上,经酶切和测序验证,用293T人胚肾细胞包装p300 siRNA慢病毒,感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低p300表达的稳定细胞株,通过实时定量PCR和Western印迹检验RNAi的干扰效果,利用细胞生长实验检测p300 siRNA对ZR75-1细胞生长的影响。结果:酶切和测序证明构建了p300 siRNA真核表达载体;实时定量PCR和Western印迹证明构建的siRNA能有效抑制p300基因的表达,并建立了敲低p300表达的稳定细胞株;细胞生长实验证实p300 siRNA可有效促进ZR75-1细胞的生长。结论:构建了p300基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效抑制p300基因的表达,且能促进ZR75-1细胞的生长,表明构建的p300 siRNA具有功能。     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

维甲酸受体β基因RNAi表达质粒的构建及其对A549细胞增殖和分化的影响

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,构建针对维甲酸受体（RAR）β基因的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,诱导RARβ基因沉默,并观察其对肺癌细胞A549株的细胞周期和增殖的影响。方法：依据设计siRNA的原则。针对人RARβ的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到pSUPER-NEO-GFP真核表达载体中构建重组体pSUPER-RAR[β转染至A549细胞中,以空质粒和RARβ高表达质粒转染为对照,用Western印迹检测RARβ基因的表达,并采用M1Tr试验检测转染后细胞株的增殖和细胞分化情况。结果：表达人类RARβ基因的siRNA重组表达质粒构建成功;MTT试验结果表明,转染的A549-RARβ-si细胞增殖能力降低。结论：采用RNAi技术特异阻断RARB基因表达,通过转染A549细胞,可使其细胞形态发生变化,并抑制其细胞生长。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

抑制麻疹病毒体外复制的效应性小干扰RNA的鉴定

为了鉴定抑制麻疹病毒体外复制的靶向Rab9GTPase基因效应性小干扰RNA（siRNA）,根据。iRNA设计原则和Rab9GTPase基因的mRNA序列,设计并化学合成8对靶向Rab9GTPase基因的siRNAs和1对阴性对照siRNA,经脂质体法转染Vero—E6细胞株,转染10h后感染麻疹病毒Edmonston株。通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测转染后细胞内Rab9GTPasemRNA水平;通过标准蚀斑试验检测麻疹病毒滴度。同对照组相比,8对靶向Rab9GTPase基因siRNAs中的2对（Rab9-4和Rab9—7）,以时间和剂量依赖性的方式显著地抑制细胞内Rab9GTPasemRNA表达和麻疹病毒的复制（抑制率高达90％以上）,其他的siRNAs对细胞内Rab9GTPasemRNA表达和麻疹病毒的复制的抑制性效应则低于50％。结果表明,Rab9-4和Rab9—7是体外抑制麻疹病毒复制的最有效的siRNAs,这些siRNAs靶序列能被用来深入研究RNA干扰治疗麻疹病毒感染的可能性。     

利用RNA干扰抑制人肝癌细胞中核因子-κB p65基因的表达

目的：用小干扰RNA（siRNA）抑制核因子-κB（NF-κB）p65基因在人肝细胞癌细胞中的表达。方法：从p65的cDNA序列中挑选3个RNA干扰靶位点,用体外转录法制备siRNA,以萤光素酶基因的siRNA为对照,分别转染Hep3B和SMMC-7721细胞,用逆转录半定量PCR和免疫印迹检测siRNA对p65基因表达的抑制效率。结果：3条siRNA对p65基因的表达都有抑制作用,其中2条siRNA的抑制作用更为显著,最高抑制效率约为70%。结论：制备的p65-siRNA可用于研究NF-κB在肝细胞癌发生发展中的作用。     

siRNA干扰HSV1 gD糖蛋白基因的研究

以HSV1 gD糖蛋白基因为靶点,设计合成5对siRNA,并构建pEGFP-N1-gD融合表达质粒,脂质体法共转染Vero细胞,利用绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的特征,流式细胞仪筛选特异沉默gD表达的siRNA。然后有效siRNA转染Vero细胞并感染HSV1,通过空斑减数实验,Real-time PCR和子代病毒滴度评价其对HSV-1感染的作用。结果显示siRNA能有效抑制gD-EGFP融合蛋白和感染细胞内gD糖蛋白的表达,但对HSV-1的感染性无明显抑制作用,故选择gD作为siRNA抗病毒靶点还需进一步的论证。     

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。