一个BMD家系中DXS 164缺失突变的分析

用DXS164探针在一例BMD家系中发现有缺失突变。这一缺失跨越了p^ERT87-1至p^ERT87-15区域，缺失片段至少在50kb以上。用DMD基因内部的J-Bir和DMD基因两侧的C7和754探针确定缺失片段位于DXS164。本文还对这一家系中一正常男性可能存在754片段的重复进行了探讨。     

两个DMD cDNA片段在进行性肌营养不良症基因诊断中的应用

本文使用了缺失热点区的两个DMD cDNA片段1b-2a及8为探针检测Duc-henne型及Becker型肌营养不良(DMD/BMD)患者的基因缺失。在34例不相关患者中分别检测到5例及8例基因片段缺失,缺失检测率分别为14.7％及23.5％,总检出率为38.2％。结果表明,中国肌营养不良患者的基因缺失也不是随机分布的,主要集中于基因中心附近,其次在基因5′侧。     

中国产家蚕抗菌肽A基因部分序列的测定

从大肠杆菌感染的家蚕蛹提取RNA,用RT-PCR方法扩增未知抗菌肽基因片段,经过克隆测序,获得了蚕抗菌肽A基因的部分片段164 bp,为制备蚕抗菌肽A基因探针,筛选基因文库打下了基础.     

Dystrophin基因51号外显子缺失连接片段的克隆和测序

为了解Dystrophin基因缺失断裂点和连接片段的序列特点,以分析Dystrophin基因缺失的分子机制,利用巢式反向PCR克隆了1名51号外显子缺失DMD（Duchennne Muscular Dystrophy,DMD）患者的缺失连接片段,通过测序,确定5‘和3‘断裂点及连接片段的序列。对5‘、3‘断裂点和连接片段进行重复序列、TOPOI、TOPOⅡ酶切位点等分析。结果共测得50号内含子1614bp,确定该患者Dystrophin基因的5‘断裂点位于THE1（Transposon-like Human Element,THE）内,3‘断裂点位于L2序列内。连接片段有3bp的连接同源序列cta,局部无小的缺失、插入和碱基置换。本研究首次在50号内含子内发现-THE1序列,再次发现Dystrophin基因的缺失断裂点位于THE1结构内。反向PCR操作简单、耗时短,可以推扩应用于缺失连接片段的克隆;THE1可能与部分Dystrophin基因的缺失有关;Dystrophin基因缺失大多与同源重组无关,非同源末端连接可能参与了Dystrophin基因缺失的形成。     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

猴类pERT87-15位点的多态性分析

应用人X染色体上的pERT87-15DNA探针,分析了猕猴属的猕猴、豚尾猕猴、熊猴、毛面短尾猴和红面短尾猴等共5种89只猴子的基因组DNA,首次发现在相当于人类 pERT87-15的位点上存在着3个“等距”的多态性位点。单体型分析提示这3个多态位点位于其X染色体上。这些结果表明,人类某些基因组探针也可适用于某些灵长类动物基因组DNA的多态性分析,并为研究动物DNA及其种系发生提供了新的信息。     

DMD/BMD缺失基因的检测及其表达产物的变化

目的:检测Duchenne/Becker型肌营养不良症(DMD/BMD)患者基因缺失及其表达产物--抗肌营养不良蛋白在肌细胞中的变化,探讨其与临床病情的关系.方法:应用9对引物多重PCR技术对42例DMD/BMD患者进行基因检测;并采用免疫荧光抗体染色技术对5例DMD,2例BMD肌细胞膜上抗肌营养不良蛋白的表达观察分析,以2例正常人的肌组织作为对照.结果:共发现21例外显子缺失,缺失片段长度各异,其中16例(76.2%)累及中央缺失热区,5例(23.8%)位于5'端缺失热区,尤以48号外显子缺失频率最高.5例DMD患者胞膜抗肌营养不良蛋白染色阴性,其中1例未检出基因缺失,但抗肌营养不良蛋白无表达.2例BMD患者染色弱阳性,可见间断斑片状荧光带.结论:DMD/BMD病情轻重可能与基因缺失的数量和片段大小不呈平行关系,而是与外显子的缺失类型有密切关系;基因的表达受个体差异的影响,呈高度的遗传异质性.抗肌营养不良蛋白缺乏或表达异常是造成DMD/BMD表型的病理基础,其临床后果不仅取决于缺失程度,还取决于缺失区域的功能意义.     

滇牡丹1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),作为MEP途径的第一个关键酶,在植物萜类合成中起着重要作用。为了克隆得到滇牡丹DXS基因,我们根据滇牡丹根皮转录组数据分析结果,首先获得滇牡丹DXS基因片段。之后根据获得的该片段设计特异引物,再利用RACE和RT-PCR技术从滇牡丹根皮中获得完整的DXS基因(Pd DXS)。Pd DXS基因全长为3 137 bp,全长基因中含有一个长度为2 151 bp的开放阅读框(ORF),该开放阅读框编码了717个氨基酸,根据开放阅读框序列推导所得蛋白序列绘制分子进化树,分子进化树将该基因推断所得蛋白与葡萄DXS蛋白聚为一类,因此,两者的DXS蛋白有较高相似性。经过氨基酸序列比对后,推断滇牡丹DXS具有叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点以及转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR结果显示Pd DXS在根、茎、叶、花芽及花瓣中均有表达。本研究为确定滇牡丹中DXS的基因功能以及揭示滇牡丹中萜类化合物的生物合成提供了理论基础。     

正常中国人和DMD患者X染色体Xp~(21)区的RFLP研究

本文应用从人类X柒色体Xp~(21)区不同部位分离得到的9种DNA探针,分析了100名正常中国人,38名DMD患者及其母亲X柒色体Xp~(21)区的14个限制性位点多态性(RSP;又称限制性片段长度多态性,RFLP)。发现正常的X染色体与携带DMD基因的X染色体Xp~(21)区的RFLP频率没有明显差别;在38例DMD患者中有7例的X染色体有DNA片段缺失;在本文分析的24例患者母杀中有17例是DMD基因携带者,她们在Xp~(21)区的RFLP均存在杂合的多态性,因此可以应用RFLP连锁分析对这些家系进行DMD的产前诊断。     

抗乙型脑炎病毒单抗重链可变区基因的筛选和鉴别

为了制备抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体,以分泌抗乙型脑炎病毒单抗的51-8杂交瘤细胞株为材料,分离这一单抗的重链可变区基因。杂交瘤细胞的大分子量DNA经Bam HI部分酶切后,以λEMBL-3为载体,构建了总数为2×10~7pfu的基因文库。以抗乙脑病毒单抗重链可变区cDNA为探针,从360000个噬菌斑中筛选出9个阳性斑,经点杂交及Southern杂交证明它们都含有重链可变区基因的片段。进一步以J_(11)探针(含J_3、J_4和重链增强子)对其中4个重组体进行鉴别。经EcoRI酶切后,有3个重组体含有与肝细胞和Sp2/0细胞相同的3.8kb片段,而第4个重组体(λ8a4)没有这一片段,却有一个4.5kb片段,这是在肝细胞和Sp2/0细胞中不存在的。从而证明前3个重组体的插入片段是未经重排的重链可变区基因片段,而λ8a4中的插入片段含有经过重排的功能性可变区基因。这一4.5kb片段不能与含有J_1—J_2的探针杂交,却同时含有V_H、J,或/和J_4和增强子。进一步证明,这是一个功能性的可变区基因。因此,将这一4.5kb片段分离出来之后,在pUC19中亚克隆并作酶切图。为构建抗乙脑病毒的人-鼠嵌合重链基因奠定了基础。     

胰岛素依赖型糖尿病HLAⅡ类抗原DNA多态性研究

 用Southern DNA分析法,对正常人和胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)病人外周血白细胞DNA进行限制性片段长度多态性(RFLP)研究。HLA抗原与IDDM相关,我们用HLA-DQβcDNA探针和EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ内切酶,测得EcoR Ⅰ 2.2kb片段与正常人DR2抗原相关联(r=0.78,P=1×10~(-6),与IDDM DR2抗原无关联;此片段在DR2的正常组和IDDM组中的频率有显著差异(P=0.02)。EcoR Ⅰ 3.0kb和BamH Ⅰ 3.3kb片段在IDDM组中的频率均降低,与正常组比较其频率有显著差异(P=3.2×10~(-3)和P=1.8×10~(-3),这二片段的差异还未见报道。DNA的RFLP研究提示,IDDM病人中可能是由于基因片段的缺失或是基因结构的改变,导致经酶切后与探针杂交的结果与正常者有差异。     

甲胎蛋白基因的DNase Ⅰ敏感性和超敏感区与基因表达的关系

我们用大鼠AFP基因cDNA pRAF 87和5'端基因克隆片段为探针,分别探测了AFP基因活跃表达的胚肝组织、具表达潜能的成年肝组织以及不表达的肾组织AFP基因转录区和调控区的DNase Ⅰ敏感性和超敏感区。结果表明;胚肝组织和成年肝组织AFP基因在转录区和5'端调控区都显示出较高的DNase Ⅰ敏感性,而肾组织则不敏感。胚肝组织AFP基因存在三个DNase Ⅰ超敏感区:基因转录起始区,离转录起始区上游约-3 kb左右区域,另一超敏感区位于基因内部4.1 kb EcoR Ⅰ片段内。成年肝组织在转录起始区也存在一超敏感区,在基因内部4.1 kb EcoR Ⅰ片段显示较高的DNase Ⅰ敏感性。推测AFP基因上游-3 kb区域(1.5 kb HindⅢ片段区)DNase Ⅰ超敏感区可能与增强基因转录活性相关,而转录起始区超敏感区可能是维持细胞组织专一性表达所必需,基因转录区域内部DNase Ⅰ超敏感区可能与AFP基因维持具活跃表达或潜能表达的染色质空间结构相关。     

嗜盐古菌R1中与真核同源基因rad25启动子的序列分析和启动活性研究

在盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)R1中分析了真核同源基因rad25的转录,分析了rad25同源基因启动子片段的序列特征,用β_半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因,利用启动子探针检测技术验证了rad25同源基因启动子片段在嗜盐古生菌WFD11中的启动功能;缺失分析进一步确认了rad25同源基因启动子具有嗜盐古菌启动子典型特征。从启动子和转录水平上证明盐生盐杆菌R1中真核同源基因rad25存在生物学功能,推测其可能在核苷酸切除修复(NER)起作用。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

3个X-STR基因座荧光标记复合扩增

为研究DXS6803、DXS981和DXS68093个基因座多态性及其在法医学中的应用,建立X染色体基因座（DXS6803、DXS981和DXS6809）的荧光复合扩增体系。用荧光标记引物PCR技术复合扩增3个基因座,并用ABI PRISM 3100毛细管电泳及其软件进行基因分型。结果在中国汉族340名无关男性个体及195名无关女性个体中,DXS6803、DXS981和DXS6809三个基因座分别发现了13、12、11个等位基因,男性个体共检出183种单倍型,单倍型多样性为0．9926。结果表明这3个基因座有较高的多态性信息,在个体识别和亲权鉴定（特别是在缺失双亲的特殊检案）中有重要的应用价值。     

龙葵叶绿体ATP合酶α-亚单位基因的克隆

本研究以菠菜叶绿体DNA 2.45kb的SalI片段(含有ATP合酶α-亚单位基因)为探针,从龙英叶绿体DNA BamHI片段文库中筛选出含龙葵叶绿体atpA基因的克隆。通过Southrcn吸印与探针杂交,证明了重组质粒pSB 132的插入片段含有atpA基因。同时将atpA基因定位在龙葵叶绿体DNA SalI、BglI、XhoI和BamHI 4种酶切图谱的限制性片段上。     

牛α—s1酪蛋白基因5’端及上游区的克隆鉴定和部分序列分析

本文以PcR法克隆得到牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段,并以该片段为探针,筛选了以EMBL3为载体构建的牛基因组文库,得到一个阳性克隆。酶切该克隆,并以牛α—s1酪蛋白基因5’端800bp片段及该基因cDNA为探针杂交,鉴定了该插人片段的方向,亚克隆了各相应酶切片段,制作了较为详细的限制酶图谱,并分析了该基因转录起始点前后部分序列。与该基因现有的资料比较,酶切图谱存在部分位点的差异,序列存在少量突变和缺失,在5’上游区均发现有内含子及外显子部分,且缺失均发生于有重复序列的部位。     

酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子片段的亚克隆

含有3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的酿酒酵母染色体3.1kb HindⅢ片段,已被克隆到大肠杆菌-酵母菌穿梭载体pCN60上。Kpn Ⅰ核酸内切酶在pCN60上没有酶切位点,而在pCN60(PGK1)上仅有一酶切位点。用此酶将pCN60(PGK1)质粒完全酶切,再用Bal31从两端逐步消解碱基对,使反应终止于每端消解500bp左右,加上EcoR Ⅰlinker。用EcoRⅠ、BamH Ⅰ酶切,分离1. 9kb的DNA片段,插入用同样双酶切的酵母启动子探针载体pVC727上,转化E.coli C600,再从转化子中提取重组质粒转化酵母受体菌NA87-11A。用菌落染色法筛选出PHO5基因高效表达转化子,这个转化子质粒含有1.9kb的BamH Ⅰ、EcoRⅠ酶切片段,它具有强启动子功能,并测定其3'末端序列。     

中国人群中抗肌萎缩蛋白基因突变类型和分布特点及其与临床症状的相关性

假性肥大型进行性肌营养不良症(Duchenne’s muscular dystrophy,DMD)是源于横纹肌的一种X-连锁隐性致死性遗传病,由编码抗肌营养不良蛋白(dystrophin)基因突变所致。为了探讨中国人群中DMD患者的dystrophin基因突变类型和分布特点及其与临床症状的相关性,文章采用Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification(MLPA)方法对720例DMD患者及其母亲和20例正常成年男性进行dystrophin基因分析。结果显示,检出率为64.9%(467/720),54.3%(391/720)的患者为基因缺失;10.6%(76/720)的患者为基因重复。累及Exon45-54缺失突变型占全部缺失型患者的71.9%(281/391);重复突变型累及Exon1-40占全部重复型患者82.9%(63/76);检出的患者中,DMD型和中间型营养不良症(Intermediate muscular dystrophy,IMD)型占90.6%(423/467),Becker型营养不良症(Becker muscular dystrophy,BMD)型占9.4%(44/467)。表明假肥大型肌营养不良症以dystrophin基因缺失突变为主,突变发生在整个基因中非均匀分布,存在突变热区,在缺失和重复的位置和片段长度与肌病的临床症状严重程度之间并不存在简单的相关关系。     

悬铃木不育突变体的分子机理研究

对以前用基因组相减技术分离的一个2．0kb的DNA片段,进行序列分析并进行同源性比较的结果显示,重组子pBS2.0对中插入的片段是悬铃木高分子量谷蛋白基因的一个亚基。以来源于拟南芥的AP1基因为探针,进行分子杂交的结果显示,突变体和野生型中都存在AP1基因,但突变作条文图谱产生了多条新谱带,杂交信号明显增强。提示突变体不育可能是高能辐射导致基因组DNA的缺失、重复和重组的结果。