冠瘿瘤基因在植物体中的表达

1　实验目的利用质粒转移技术将有用 (目的 )基因整合到植物基因组 DNA中 ,创造出植物遗传新类型。本实验用根癌农杆菌介导 ,将菌体中的冠瘿瘤基因 (T- DNA)导入桑、紫景天中 ,使其形成植物瘤。通过本实验操作 ,可使学生了解植物转基因技术的基本原理 ,提高对生物课程学习的兴趣具有重要意义。2　实验原理植物经人工刺伤并感染农杆菌后 ,因伤流中含有一定量的酚类、氨基酸、糖等有机物 ,这类物质能诱导农杆菌合成参与 T- DNA剪切、加工、转移的酶系 ,并将 T-DNA整合到宿主细胞的基因组 DNA中。由于 T- DNA中有编码生长素 (tmsl、tm…     

向植物导入外源DNA方法的研究与发展

为满足人类对粮食和其它农产品的多种需求,利用现代生物技术手段培育高产,稳产、优质、抗病虫,抗逆植物新品种是农业生物技术研究的主要内容之一。对植物进行遗传改造的首要环节是,研究和开发向植物细胞导入外源基因的技术。近年来,向植物细胞导入外源DNA的方法在实践中不断创新发展。目前主要采用的方法有以下几种: 一、根癌土壤杆菌介导的外源基因转移 整合型的根癌土壤杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。研究最多的是octopine(章鱼碱)型和nopaline(胭脂碱)型Ti质粒。在Ti质粒上有一段T-区,T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25bp正向重复序列可能接受某种酶识别切割,进而形成环状中间体。此外,Ti质粒上还有—个约50kb的Virulence区(简称Vir区),约有十几个基因。Vir区不在T-DNA内。Vir产物是一     

Ti质粒基因在单子叶植物中的表达

<正> 根癌农杆菌感染双子叶植物时,能侵入双子叶植物的细胞壁,并通过一种未知机制将其Ti质粒DNA导入植物细胞内。导入的Ti质粒DNA(T-DNA)能整合到植物细胞的核基因组中,并被转录。通过遗传操作插入Ti质粒T区的任何DNA片段似乎都能随根癌农杆菌一起转移到植物细胞内。因此,根癌农杆菌作为载体,已广泛用于高等植物外源遗传物质的导入研究。它最终有可能给作物的基因组加入一些有益的遗传成分。遗憾的是,把Ti质粒用作转     

根癌农杆菌毒力调节基因在识别寄主植物及T-DNA转移的作用

土壤病原菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)通过遗传转化植物细胞,引起许多植物(主要是双子叶)发生冠瘿病。转化实质在于农杆菌DNA中的一个特殊片段,T-DNA从大的(>200Kb)Ti质粒转移到植物细胞核     

我国葡萄根癌农杆菌Ti质粒的特征

以窄宿主葡萄农杆菌Ag162Ti质粒的T-DNA区tmr、tmsl和ocs基因座位以及T_A-DNA和T_B-DNA片段为探针,对12株我国分离的不同生物型、质粒类型和寄主范围的葡萄根癌农杆菌的引质粒转移DNA(T-DNA)进行Southern杂交分析。在9株生物3型octoplne Ti质粒菌株中,与上述探针均同源。其中窄宿主葡萄根癌农杆菌菌株杂交片段彼此较一致。广宿主葡萄根癌农杆菌菌株的杂交片段彼此差异较大。1株无致瘤能力的生物1型菌株与5个探针均不杂交。1株生物3型nopaline Ti质粒菌株及1株诱导冠瘿瘤中只合成精氨酸的菌株,杂交带的变化也大。由此可见葡萄农杆菌在生物进化过程中其转移DNA呈多态性,成为农杆菌中特殊类群。本分析对葡萄根癌农杆菌致病菌株的鉴定亦有帮助。     

农杆菌T-复合物的形成与转运研究进展

在简要介绍农杆菌T-DNA转运全过程的基础上,结合作者近年的工作,重点对T-复合物的形成和T-复合物在农杆菌细胞内的转运机理的最新进展进行归纳和评述．农杆菌能够将其Ti质粒上的一段DNA以单链DNA-蛋白质复合物(简称T-复合物)的形式,通过其细胞两端的四型分泌系统(typeⅣ secretion system,T4SS)转运到宿主植物中,并使宿主发生遗传转化,因而农杆菌介导的T-DNA转运技术已成为应用最广泛的植物转基因技术,同时,由于转运T-复合物的T4SS也是某些质粒接合转移和许多病源微生物分泌致病效应蛋白的通道,因此,农杆菌T-DNA转运机理的研究受到了广泛的重视和关注,使得这方面的研究进展非常迅速．     

迅速发展的植物基因工程

70年代后期,植物肿瘤发生的分子生物学研究取得了重大进展,证明根癌农杆菌能将Ti质粒的特定区段(即T-DNA)转移进植物细胞;T-DNA编码的基因整合进植物基因组后不仅发生表达,并且能成为植物的新增的一群基因稳定地保存下来,通过     

Ri质粒基因转化植物细胞的机理

发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)含有一个约250Kb的大质粒,与Ti质粒转化植物细胞产生冠瘿瘤(crowngall)相似,它也可以侵染双子叶植物受伤部位的细胞并产生大量不定根(所谓发根或毛状根,(hairyroot),因此,这个大质粒被称为Ri质粒(根诱导质粒,Root-inducingplasmid)。     

植物遗传工程研究中一种潜在的Ti质粒载体pTiBo542的限制性内切酶图谱

我们在这篇论文中报道了pTiB0542的物理图谱。pTiB0542是一种根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的广谱寄主的肿瘤诱导质粒。限制性内切酶BamHI消化产生42种片段,经用电泳技术分析含有pTiB0542部分重叠的克隆,结果发现它们是以环状排列的。根据pTiB0542的T-DNA区段与异源的章鱼碱Ti质粒和蓝曙红Ti质粒的T-DNA的同源性,从而确定了pTiB0542的T-DNA区段(Ti质粒移转到植物里去的那部分)。这一部位的克隆作为探针,与大豆肿瘤DNA进行Southern杂交,进一步证实这种论断。     

植物冠瘿瘤发生的分子基础

Smith和 Townsent(1907)首先发现植物冠瘿瘤是由农杆菌诱发的。三十五年后,Braun等(1942)发现,冠瘿瘤组织能在正常细胞不能生长的培养基(不附加生长素和细胞分裂素)上无限制地生长,后来他们又进一步证明,冠瘿瘤是农杆菌转化植物细胞的结果,转化一旦完成,冠瘿瘤的生长就不再     

农杆菌与植物细胞的相互作用

近年来,植物遗传工程的研究进入了一个飞速发展的时期。T_i质粒和R_i质粒是应用最普遍的两个基因工程的载体。它们是分别存在于根癌农杆菌(Agrobaeterium tumofaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)细胞核外的一种双链环状DNA。人们将控制优良性状(如高产、抗病虫害、抗旱等)的基因通过一定方法整合到T_i或R_i质粒上的T-DNA区,然后借助于农杆菌对植物的感染,将外源基因引入植物细胞并整合     

植物基因载体—Ti质粒的应用方法<下>

根癌农杆菌使许多双子叶植物产生冠瘿瘤是其Ti质粒的T区DNA转入植物细胞的结果,Ti质粒是天然的植物基因载体。为克服直接操作Ti质粒的困难,人们构建了中间载体,将嵌合基因插入中间载体构成表达载体。改建的Ti质粒——pGV 3850等系统,是缺失了致瘤基因,但保持转化植物细胞的能力的Ti质粒。双质粒系统,SEV系统则是进一步完善化的Ti质粒载体。另外我们还讨论了构建其它基因载体,开辟多种转化途径的必要性。     

高等植物的遗传转化

自1944年Avery首次阐明肺炎双球菌的遗传转 化机理后,人们一直在探索适合高等植物的转化途径, 但早期用DNA直接处理种子或细胞均未取得成功。,。 197;年,Van LarebekeEs',等在根癌农杆菌中发现一 种与双子叶植物肿瘤诱导有关的质粒,即Ti质粒‘ 1977年ChiltonL",等用限制性内切酶谱法证明,在植 物的冠廖瘤组织中存在农杆菌Ti质粒的一个片段,称 为转移DNA (T-DNA), T-DNA在植物基因组中的 整合和表达导致肿瘤的发生。此后以Ti'质粒为基础 的植物遗传转化研究获得迅速发展,在理论和应用方 面均取得很大成就“,‘。本文主姿对植物转化的机理 和方法进行综述。     

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的 Ti 质粒(二)

转移 DNA—T—DNAChilton 等人利用同位素标记的 Ti 质粒做探针,发现加入高浓度烟草肿瘤的 DNA 后 Ti质粒 DNA 的复性速度有加快的趋势,表明肿瘤 DNA 中有 Ti 质粒的顺序,但该顺序不多,而且没有检测到完整的 Ti 质粒。以后这些作者将章鱼肉碱型的 Ti 质粒 B6—806用内切酶Smal 分解成19个片段,分别用同位素标记做成探针,然后与肿瘤进行分子杂交,结果有二段 Ti 质粒的 DNA(3b 和10c)能和肿瘤 DNA杂交,这是二个相邻近的片段,称为 T-DNA(图4)。Ti 质粒中与肿瘤 DNA 同源的 DNA     

拟南芥激活标记突变体库的构建及突变体基因的克隆

激活标记(activation tagging)技术是以功能获得突变体为研究对象,在植物功能基因组学的研究中具有重要的作用.文章以双子叶模式植物拟南芥(Arabudidopsis thaliana)野生生态型植株为实验材料,以含有激活标记质粒pSKI015的农杆菌直接喷雾进行转化,并以抗除草剂Basta为筛选标记,构建了拟南芥的激活标记突变体库.结果共得到约20 000个独立转化株系(T1代),其中38个株系有明显的表型变化,约占转化植株总数的千分之二.基因组DNA Southern杂交结果表明,大多数转化植株为多拷贝T-DNA插入.通过质粒拯救(plasmid rescue)和TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR)可获得T-DNA插入的基因组旁邻序列,为克隆突变体的基因奠定基础.     

利用PCR方法鉴定hiTAIL-PCR扩增产物中的质粒骨架片段

T-DNA突变体是研究基因功能的重要资源。高效热不对称交错PCR (hiTAIL-PCR)是克隆突变体中T-DNA插入位点侧翼序列的常用方法。然而我们发现, 利用hiTAIL-PCR克隆到的一些侧翼序列并不对应于宿主的染色体DNA序列, 而是质粒的骨架DNA片段。通过设置1组RB-S4/AC1或者LB-A4/AC1对照反应, 用PCR方法鉴定了hiTAIL-PCR扩增产物中位于T-DNA侧翼的质粒骨架片段。在后续分析中, 通过排除这些片段, 提高了利用hiTAIL-PCR获得宿主染色体DNA片段的效率。同时, 通过调整反应程序, 使得整个PCR的反应时间也大为缩短。在拟南芥(Arabidopsis thaliana) T-DNA突变体drf1侧翼序列的克隆实例中, 对照反应的引入将hiTAIL-PCR中需鉴定的22条扩增产物降至4条, 效率提高了81.8%。     

甜菜致瘤及T-DNA的转移

致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 的细胞中除了染色体以外,还有Ti质粒,它能 通过植物被擦伤的部位感染植物,进人细胞中 去。Ti质粒上的一小段T-DNA 可以随机地 与细胞染色体结合,从而导致植物细胞迅速分 裂而结瘤。在瘤组织的细胞中可以合成章鱼碱 (Octopine）或胭脂碱（Nopaline) o感染后的植 物细胞另一个重要特征就是在无激素的培养基 上生长。这个试验体系已经应用于植物遗传工 程[2l。在茄科植物如烟草^[4]、龙葵Ell植株中TDNA 已经能够表达。这些T-DNA转移成功 的例子使国内外许多学者试图应用于重要的经 济作物— 甜菜(Beta vulgaris）上来。虽然 致瘤农杆菌可以使甜菜致瘤^[5],然而T-DNA 在甜菜基因组中能否转移和表达,则尚未见报 道,而这正是利用Ti质粒做为遗传载体的关 键。本试验正是针对这个问题而设计的并得到 了肯定的结果。     

植物细胞的转化系统

本文系统地论述了目前植物细胞各种转化系统的技术特点、基本原理和研究进展,对植物细胞转化概念的广泛含义进行了初步的讨论,文中指出了转化系统对植物细胞分子遗传学及遗传工程的重要意义,最后指出了转化系除了上述各种转化系统外,用已转化的冠瘿瘤细胞原生质体与正常的原生质体融合也能实现 T-DNA 的转移,并得到属间体细胞杂种。这是一种借助细胞融合技术的转化系统。     

植物基因载体—Ti质粒的应用方法<上>

七十年代中期,在生物化学、分子生物学、DNA重组技术及细胞培养技术的发展基础上,出现了一个新的研究领域——植物基因工程。由于传统的农业育种工作对新技术的迫切需要,高等植物之基因工程一开始就发展迅猛。植物基因工程的关键是如何将外源DNA引入具有细胞壁的植物细胞,Chilton等(1977)证明,根癌农杆菌使许多双子叶植物产生冠瘿瘤是其     

发根农杆菌Ri质粒在药用植物生物工程中的应用

发根农杆菌(Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ)与根癌农杆菌(Ａ.ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ)属于根瘤菌科,均为革兰氏阴性菌[1]。它们在侵染植物后引起的症状不同,含有Ｔｉ质粒的根癌农杆菌在侵染植物后形成冠瘿瘤(ｃｒｏｗｎｇａｌｌ),而含有Ｒｉ质粒的发根农杆菌表现与其不同,它在感染植物后在植物的伤口部位诱发产生毛状根(ｈａｉｒｙｒｏｏｔ)。由发根农杆菌侵染植物诱导产生的毛状根具有生长快、分枝多、根毛多等特点。发根农杆菌Ｒｉ质粒与根癌农杆菌Ｔｉ质粒结构相似,都具有高效率转移的Ｔ-ＤＮＡ区和致病的Ｖｉｒ区…