应用F(ab'''')_2~-酶联吸附分析法检测大麦黄花叶病毒

F(ab′)_2酶联免疫吸附分析法(F(ab′)_2-ELISA)成功地用于大麦黄花叶病毒(BaYMV)的常规检测和诊断.其步骤是先用稀释1000—4000倍的抗血清F(ab′)_2包被反应板,加待测样品和稀释1000倍的同种抗血清或IgG,然后再加A蛋白碱性磷酸酯酶和底物,测定OD值。比较试验表明,ELISA稀释缓冲液加入1％小牛血清或1％全脂奶粉,BaYMV的测检灵敏度可提高达2.5—5.0ng/ml,病叶汁液检测终浓度为稀释1600—3200倍。我国BaYMV分离物与英国分离物的血清学性质完全一致。BaYMV在大麦病株中以叶部含量较高,茎中含量次之,根部测不出病毒。检测和诊断田间样品,即使有的样品已不新鲜,也均能得到满意的结果。此方法也成功地用于大麦温和花叶病毒(BaMMV)、小麦黄花叶病毒(WYMV)、燕麦花叶病毒(OMV)和燕麦金色条纹病毒(OGSV)等禾谷多粘菌传麦毒的检测,这S种病毒的血清学关系研究表明,除BaYMV和WYMV之间具有血清学关系以外,其余彼此均不反应。     

我国大麦和性花叶病毒（BaMMV）研究初报

本文根据F(ab′)2－ELISA和ISEM实验,结合病毒粒子长度测定,报道了江苏省如东县农科所大麦黄花病毒源（吕种盐辐矮早3）中除存在大麦花花叶病毒（BaYMV）外,还复合感染大麦和性花叶病毒（BaMMV）,这是我国BaMMV的第一次报道。     

应用免疫电镜技术快速检测菜豆黄花叶病毒、马铃薯M病毒和燕麦花叶病毒

应用免疫吸附电流技术(ISEM)可有效地检测腐汁液中的菜豆黄花叶病毒(BYMV)、马铃薯M病毒(PVM)和燕麦花叶病毒(OMV)。BYMV,PVM和OMV三种抗血清的适宜工作浓度和对铜网的适宜包被时间均为1000倍和1小时,对同源病毒的适宜捕获时间分别为4℃下2、2和8小时。PVM和OMV的病汁液检测灵敏度均为稀释4000倍,而BYMV病汁液稀释16000倍时还能检测到少量病毒料子。ISEM捕获法和修饰法的结果表明,这三种病毒之间无血清学交叉反应。     

大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测

对大麦黄花叶病毒属成员的同源性和系统进化树分析表明,同一病毒RNA1和2基因组5′-UTR区域在进化上的相关性高于不同病毒同一RNA组分间的关系,而3′-UTR则相反.蛋白质二级结构分析显示RNA1编码的P3和14K蛋白存在跨膜结构.BaMMV ALS1分离物P3蛋白跨膜结构在大肠杆菌中原核表达时有致死作用.类比Potyviridae科其它属成员功能,此2个蛋白可能与膜附着功能相关.RNA2编码的P2蛋白存在两个结构保守的跨膜区域,一些摩擦接种保存的大麦和性花叶病毒(BaMMV)分离物和燕麦花叶病毒(OMV) P2蛋白此两个结构(或一个)缺失后,不能由介体禾谷多粘菌(P. graminis)传播,揭示P2蛋白跨膜结构与禾谷多粘菌传播能力相关.     

豇豆病毒病病原的分子鉴定

为澄清浙江省豇豆病毒病病原及其分类,采用马铃薯Y病毒属通用引物Sprimer扩增了浙江豇豆线状病毒基因组3′－末端序列。同时又根据已知CMV RNA3序列设计引物pCMV-44-63/1200-1181,扩增了混合的CMV－ZJ运动蛋白基因全序列。外壳蛋白氨基酸序列分析表明,产中仅存在一种线状病毒（CV－ZJ）,该病毒与一泰国豇豆蚜传花叶病毒（CABMV）具有最高的同源性（98.6%）,与花生条纹病毒（PStV）、石斛花叶病毒（DeMV0．）、赤豆花叶病毒（AZMV）、黑眼豆豆花叶病毒（BICMV）和菜豆普通花叶病毒（BCMV）分离物间的同源性为88.5%－94.4%,而与其它CABMV分离物的同源性均低于70％。进化树分析表明,PStV、AZMV、DeMV、BlCMV和BCMV为同种异名,应统称为BCMV,而CABMV为另一种病毒;CV－ZJ和泰国CABMV分离物应分类为BCMV豇豆株系。CMV－ZJ的运动蛋白序列分析表明,该分离物属于CMV亚组Ⅰ,与其它分离物氨基酸序列同源性为93.1%－97.8%。     

齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus,ORSV)。通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月。提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体。SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa。该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物。用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究。     

应用斑点法检测植物病毒的研究

应用斑点法检测了病叶粗汁液中的芜菁花叶病毒(TuMV)、大豆花叶病毒(sMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),病叶粗汁液可被检测的最大稀释度分别为1:5120、1:2560和1:1280。提纯的大豆花叶病毒和黄瓜花叶病毒可检测的最低限量分别为1.7ng和1.2ng。以牛血清白蛋白、吐温和聚乙烯吡咯啉酮作封闭液,均可获得满意的结果。应用斑点法检测芜菁花叶病毒和大豆花叶病毒时,其抗血清稀释1:500倍可获得满意效果,稀释2000倍仍可用于检测。     

反向炭凝法检测水稻普通矮缩病毒带毒体

本文探讨了水稻普通矮缩病毒(RDV)抗血清制备免疫抗体的方法及其对带毒体的检测。用化学纯活性炭为载体,制备RDV抗血清免疫炭抗体,抗血清需要纯化处理,具有结合抗原活性的抗体碎片[F(ab)2]优于免疫丙球蛋白(IgG)。F(ab)2浓度以每毫升约1毫克左右为宜,致敏条件以22—30℃碾磨结合30分钟为优。     

黄瓜花叶病毒CP基因原核表达及抗血清的制备

把黄瓜花叶病毒 (CMV)西番莲分离物的外壳蛋白 (CP)基因 ,通过BamHI SacI位点定向插入pET 2 2b( )载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)中 ,经IPTG诱导下 37℃培养 6h ,SDS PAGE电泳示表达蛋白分子质量为 31 8kDa ,表达量占菌体总蛋白的 2 8 9%,表明该蛋白得到了高效表达。用冰冷的氯化钾溶液显色 ,用表达的特异蛋白质条带制备抗原 ,免疫家兔制备出病毒特异抗血清。采用ID ELISA测定抗血清效价为 1 0 -6;抗血清和CMV几个分离物均有特异反应 ,和TMV、菌体蛋白不发生非特异性反应 ;检测病毒灵敏度达 30ng ml,能够从稀释 31 2 5倍的感病植物汁液中检测出病毒     

侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备

在广西临桂罗汉果花叶畸形病株上获得了一个线状病毒分离物LGL-1,寄主范围、蚜传能力测定、病毒粒子形态和细胞病理特征研究表明,它是马铃薯Y病毒科成员.采用马铃薯Y病毒科特异性简并引物做PCR扩增,并测定了分离物LGL-1的基因组3′-末端序列,序列分析表明它是小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）.系统进化树分析揭示,世界范围内的ZYMV分离物主要可分为3大群体,分离物LGL-1为中国特有群体Group Ⅲ成员.原核表达制备了分离物LGL-1的外壳蛋白抗血清,明确了ZYMV是引起广西罗汉果病害的主要病毒,并且比较了原核表达法和提纯病毒法制备的抗血清,在病样的间接ELISA法检测中结果的差异.     

大麦黄花叶病毒属成员UTR系统进化树分析及编码蛋白跨膜结构推测

对大麦黄花叶病毒属成员的同源性和系统进化树分析表明 ,同一病毒RNA1和 2基因组 5′ UTR区域在进化上的相关性高于不同病毒同一RNA组分间的关系 ,而 3′ UTR则相反。蛋白质二级结构分析显示RNA1编码的P3和 14K蛋白存在跨膜结构。BaMMVALS1分离物P3蛋白跨膜结构在大肠杆菌中原核表达时有致死作用。类比Potyviridae科其它属成员功能 ,此 2个蛋白可能与膜附着功能相关。RNA2编码的P2蛋白存在两个结构保守的跨膜区域 ,一些摩擦接种保存的大麦和性花叶病毒 (BaMMV)分离物和燕麦花叶病毒 (OMV)P2蛋白此两个结构(或一个 )缺失后 ,不能由介体禾谷多粘菌 (P .graminis)传播 ,揭示P2蛋白跨膜结构与禾谷多粘菌传播能力相关     

大麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备

大麦黄花叶病毒(Barley yellow mosaic virus,BaYMV)广泛分布于西欧、日本和我国长江中下游和东部沿海地区,严重危害了大麦生产,并呈现出不断蔓延扩大的趋势。该病毒经土壤禾谷多粘菌介体感染大麦后,病毒繁殖发病的状况,易受到大麦品种不同、环境温湿度等因素的影响,发病程度的差异很大,而且还发现带毒隐症的大麦品种,使大麦抗源筛选和大麦抗性品种的选育工作受到严重干扰,因此迫切需要建立一种快速、灵敏和准确的检测方法。目前,比较理想的方法是ELISA等免疫学技术。     

乳胶溶液电镜在检测线状和棒状植物病毒中的应用

建立了一种检测线状或棒状植物病毒的新的电镜技术。用聚苯乙烯乳胶预先包被铜网用以测定烟草花叶病毒,马铃薯X、Y病毒,玉米矮化花叶病毒表明,铜网上沾附的病毒数量与免疫电镜法相似,比直沾法多几倍至十几倍。乳胶溶液电镜法不需制备特异抗血清,方法简便快速,特别适合于植物样品的初次病毒检测工作。     

间接酶联免疫吸附试验快速检测无毒唐菖蒲试管苗

本文利用间接酶联免疫吸附试验检测了从北京地区栽种的唐菖蒲上分离到的一株病毒的提纯制品和唐菖蒲试管苗的病叶粗提液。用提纯的病毒免疫家兔,抗血清的滴度为1：62500。提纯病毒的最适包被浓度为2．5μg/ml。能检测提纯病毒的最低浓度为4ng／ml。侵染性试验检测提纯病毒的最低浓度为30Ⅱg／mI。在间接酶联免疫吸附试验中,该病毒与烟草花叶病毒普通株有血清学相关性。     

单抗免疫斑点法和组织印迹法检测侵染蝴蝶兰的建兰花叶病毒

应用抗建兰花叶病毒(CymMV)的单克隆抗体, 建立了快速检测蝴蝶兰病样的免疫斑点法(Dot-ELISA)和组织印迹法(Tissue blot-ELISA)。CymMV单抗稀释8000倍时, Dot-ELISA可检出病毒粗汁液的最大稀释度为1:10240; Tissue blot-ELISA中样品1次平切后1~5次印迹与Dot-ELISA样品1:80稀释结果相当, 6~8次印迹与Dot-ELISA 1:320稀释结果相当, 前8次印迹均可以得到满意的检测效果。Tissue blot-ELISA的灵敏度略低     

引起番茄坏死病的黄瓜花叶病毒TN分离物的研究

从南京郊区田间番茄坏死病株中分离出黄瓜花叶病毒ＴＮ分离物,经人工接种１０科３９种植物,能侵染其中的８科２６种,接种番茄,辣椒和普通烟都引起坏死症状。ＴＮ分离物的失毒温度为５０℃,稀释限点５×１０￣（－３）－５×１０￣（－４）,体外存活期１－２天。蚜虫以非持久性方式传毒,经免疫双扩散测定,ＴＮ分离物与黄瓜花叶病毒抗血清呈阳性反应。用差速离心提纯的病毒粒子经电镜观察为廿面体,直径为２８ｎｍ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析病毒外壳蛋白为单一组份,分子量２７５００Ｄ。病毒核酸组份分析发现,该病毒分离物含有ＣＭＶ基因组核酸和一个低分子量的卫星ＲＮＡ。以上结果同已报道的引起番茄坏死的带卫星ＲＮＡ的黄瓜花叶病毒株系一致（Ｋｅａｒｎｅｙ,Ｃ．Ｍ．１９９０;Ｊｏｒｄａ,Ｃ．１９９２）。本文还讨论了该病害的发生和流行。     

齿兰环斑病毒的鉴定及其抗血清的制备与应用

根据病毒生物学特性、粒体形态和血清学性质等初步确定从在厦门地区种植的表现为褪绿、褐色坏死斑症状的卡特兰(Cattleya)病株上分离的一个病毒分离物为齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV).通过摩擦接种6科27种(或品种)指示植物,结果其中4科8种(或品种)表现症状,与烟草花叶病毒不同;理化性质试验表明稀释限点为5×10-5,致死温度为92℃～94℃,体外存活期超过3个月.提纯病毒为长约300nm,宽约18nm杆状粒体.SDS-PAGE电泳分析表明其外壳蛋白分子量约为17kDa.该分离物与ORSV抗血清具有强阳性反应、而与TMV抗血清反应微弱,认为该病毒为ORSV分离物.用纯化病毒免疫家兔,成功地制备出特异性抗血清,并通过Dot-ELISA法对厦门地区种植的兰花病株进行了检测研究.     

芝麻病毒病病原研究——Ⅰ.芝麻矮化坏死病害的鉴定

在湖北武昌芝麻上分离到的矮化坏死分离物(DNe-I)侵染芝麻引起严重矮化,叶片皱缩坏死。它能够摩擦接种侵染7科14种植物。在苋色藜、千日红上引起局部坏死斑,侵染油菜和百日菊引起系统花叶和黄化。DNe-I能够被桃蚜、花生蚜以非持久性方式进行传播。病毒体外稳定性状:存活期4天,钝化温度60～65℃,稀释限点4×10~(-4)。提纯病毒为线状粒体,长度为770nm。病毒外壳蛋自为单一亚基组成,分子量为30,700±600D。制备抗血清微量沉淀法测定其效价为1:256。在油菜病组织中,观察到风轮状及长直片层叠聚体类型的胞质内含体。在血清学性质上,该分离物与芜菁花叶病毒密切相关,与花生轻斑驳病毒和花生斑驳病毒弱相关,与大豆花叶病毒和西瓜花叶病毒不相关。基于上述性质,DNe-I被鉴定为芜菁花叶病毒。这是国内芜菁花叶病毒自然侵染芝麻的首次报道。     

香蕉试管苗黄瓜花叶病毒检疫检验技术研究

建立了香蕉试管苗黄瓜花叶病毒ＤＡＣ－ＥＬＩＳＡ检测技术。应用０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．２,内含１％ＮａＤＩＥＣＡ）作为样品制备缓冲液,检测灵敏度可达到１／５１２０（稀释度）。两年来检测了１２８７个样品,香蕉试管苗生产繁殖材料的带毒率为２．８％。     

中国六省,市辣（甜）椒病毒种群及其分布的研究

１９８３－１９９１年间,国家“６５－７５”重点科技攻关项目协作组,在京、津、辽、苏、吉、新六个地区,采集辣（甜）椒病毒病标样３６１８个,采用三常规（生物、血清、电镜）鉴定手段分离出烟草花叶病毒（ＴＭＶ）、黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）、马铃薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ）、烟草蚀纹病毒（ＩＥＶ）、苜蓿花叶病毒（ＡＭＶ）、蚕豆萎蔫病毒（ＢＢＷＶ）、烟草脆裂病毒（ＴＲＶ）等八种病毒;描述了它们的生物学、血清学、电镜学性状及危害辣（甜）椒的特性;分析了各类病毒在不同地区、季节的消长规律,明确了各地辣椒上的主导病毒病原,为抗病育种及制定综合防治措施,提供了科学依据。