棒杆菌质粒pXZ10145复制功能区定位

将棒杆菌质粒pXZ10145或pNAT65的不同酶切片段装入大肠杆菌质粒pACYCl77中构建了pTSK系列重组质粒。转化棒状类细菌的实验结果确定了质粒pXZ10145上复制必需区的位置。质粒pXZ10145复制最小必需区定位在NaeI-NruI的1.2kb片段上,在这个片段上只有一个约940碱基的阅读框架。它编码一个质粒复制因子,以对位作用方式协助那些不能自我复制但复制起始区仍保持完整的pTSK质粒在棒状类细菌中复制。质粒pXZ10145复制起始区在一个NaeI-SalI的0.3kb片段上,位于已确定的复制因子编码框架中。     

通过接合作用质粒从大肠杆菌到棒状杆菌的转移

构建了可接合转移的穿梭质粒pXZ911、pBZ51和pBZ52。这些质粒中含有具转移功能的Mob片段和在棒状杆菌中复制的复制区。以大肠杆菌S17—1为供体菌,通过接合转移作用,可将这些质粒转移到谷氨酸棒杆菌ATCCl3032、谷氨酸棒杆菌ATCC21543、北京棒杆菌B3、北京棒杆菌1．299、裂氏棒杆菌B43、黄色短杆菌ATCC 14067等棒状杆菌苗株,接合转移频率分别为：9X10^-5,1X10^-4,8．5x10,2．3X10^-4×10^-5,2．9X10^-5。本文还探索了大肠杆菌和几种革兰氏阳性棒状杆菌问基因转移的方法、转移频率、影响转移频率的因素、宿主范围等问题。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

金霉素链霉菌启动基因在大肠杆菌中的克隆及表达

利用质粒pGA46作为载体,将金霉素链霉菌染色体DNA的Sau3A酶切片段插入pGA-46的BglII位点,获得氯霉素抗性、四环素抗性的重组质粒。DNA同源性分析表明,重组质粒中外源序列来自金霉素链霉菌DNA。重组质粒的限制性酶切产物电泳分析,可以重新找到载体DNA片段。将链霉菌的插入序列移入另一载体pBR322中,仍可表现启动基因的功能。用限制性内切酶酶切及核酸酶BAL-31酶切等方法,已将链霉菌的插入序列降至200bp以下,仍保留启动基因功能。     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因启动子的克隆、鉴定及其应用

利用TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)从短小芽孢杆菌基因组中扩增到碱性蛋白酶基因编码区上游的启动子片段。对该片段的序列测定和分析表明, 此片段长797 bp, 但与基因表达有关的序列长约390 bp。对启动子片段进行不同长度的缺失突变, 以获得最小的基因启动子片段, 结果表明, 该基因起始密码子上游约160 bp的DNA片段就可以启动基因的表达。将含有该片段的碱性蛋白酶基因WApQ3插入大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒载体pSUGV4中, 构建了碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpWApQ3。将该质粒分别转入枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中表达, 可在胞外检测到碱性蛋白酶活性, 最高酶活分别为466.5 U/mL和3060 U/mL。     

在大肠杆菌中具有启动功能的菠菜叶绿体DNA片段的克隆及序列分析

将经sau3A部分酶切过的菠菜叶绿体DNA(ct DNA),克隆到载体pGA46的BgⅢ位点,得到了具有启动功能的菠菜ct DNA片段,对其中的两个片段进行序列分析后观祭到有与原核生物启动区域相符的保守顺序。由此,本文对片段所具有的启动功能的强弱做了说明。     

棒杆菌启动子片段的酶谱分析及定位

用大肠杆菌启动子探测质粒pSDS I (Ap^r,Tc^s)从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)6282染色体的HindⅢ酶切片段中,克隆到两个具有启动功能的DNA片段,分别将两个重组质粒命名为pSDB5和pSDB21。含有这两个质粒的菌株均可以在含300μg/ml Tc的平板上生长。通过酶切分析,pSDB5的插入片段为1.6kb,pSDB21的插入片段为3.4kb,并分别作出了它们的限制性酶切图谱。对pSDB21利用其EcoR Ⅰ和BglⅡ位点,通过亚克隆删除了与启动功能无关片段,构建成pSDB210和pSDB211,从而使启动子定位于约0.1kb的BglⅡ/HindⅢ外源片段上。分子杂交实验证明所得到的这两个具有启动功能的DNA片段确实来源于钝齿棒杆菌6282的染色体DNA。     

谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭型启动子探测载体构建

从质粒pXZ10145和pUC19出发,构建了一个谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭载体pAK6。pAK6的大小为5684bp,带有卡那霉素和氨苄青霉素抗性选择标记,以及多克隆位点。在pAK6基础上,构建了以氯霉素乙酰转移酶为报告基因的启动子探测载体pAKC6,pAKC6的大小为6474bp。采用鸟枪法,将经Sau3AI消化的谷氨酸棒杆菌基因组片段连入pAKC6;根据谷氨酸棒杆菌对氯霉素的抗性,从中分离出两个具有启动子功能的插入片段。通过测定报告基因氯霉素乙酰转移酶的活性,对两个启动子片段在谷氨酸棒杆菌中的强度进行了初步的判断;测序后,用启动子预测软件对其结构进行了预测,证实了启动子序列的存在。     

一株高效抗砷喜温硫杆菌工程菌的构建

利用DNA体外重组技术,将大肠杆菌质粒载体pUM3上的抗砷基因簇片段亚克隆到含有强启动子（tac启动子）并具有广泛寄主范围特性的IncQ族质粒pMMB24上,删除调节基因片段,构建了含有强启动子、可在tra基因诱动下转移的组成型表达的抗砷质粒pSDRA4。通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性喜温硫杆菌Acidithiobacillus caldus中,构建了冶金工程菌Acidithiobacillus caldus (pSDRA4),接合转移频率为（1.444±0.797）×10-4。表明在大肠杆菌和喜温硫杆菌之间成功地建立了一个遗传转移系统。经检测,重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳定性,在无选择压力条件下传代50次基本保持稳定（重组质粒保留76% 以上）。经抗砷性能检测,与野生菌相比,构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高,从10mmol/L提高到45mmol/L。     

具有真细菌基因启动子活性的盐生盐杆菌质粒DNA片段

利用大肠杆菌启动子探测质粒ｐＫＫ２３２－８为载体、用两组限制性内切酶ＢａｍＨＩ－ＳａｌＩ和ＨｉｎｄⅢ－ＳａｌＩ分别消化盐生盐杆菌Ｊ７（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｈａｌｏｂｉｕｍ）的质粒ｐＨＨ２０５,在体外进行重组,转化Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１感受态细胞,在含氨苄青霉素和氯霉素的选择平板上筛选转化子,并从随机挑选的２０株转化子中,获得抗氯霉素水平达到１１０μｇ／ｍｌ的转化子Ｔ１和Ｔ２,所含重组质粒分别被命名为ｐＪＨ和ｐＪＢ。经限制性酶切分析及杂交分析表明,ｐＪＨ质粒上插入了一段来源于ｐＨＨ２０５质粒的ＤＮＡ片段,其大小为８００ｂｐ左右。通过重新转化实验进一步表明,该ＤＮＡ片段在大肠杆菌中具有启动子功能,从而证明,在古细菌（盐生盐杆菌）的质粒ＤＮＡ中存在具有真细菌（大肠杆菌）基因启动子活性的ＤＮＡ片段。     

枯草芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定

利用启动子探针型载体pSUPV4直接在大肠杆菌 (Escherichiacoli)中分离枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)WB6 0 0的基因启动子片段 ,获得 5 5个具有卡那霉素抗性的重组子。对 3个抗性最高的重组子pSU -Bs2 ,pSU -Bs4 ,pSU -Bs8进行序列测定和同源性分析发现 ,所克隆到的基因启动子片段均来自于枯草芽孢杆菌的基因组 ,并且具有枯草杆菌基因启动子的保守序列。对抗性最高的Bs2片段进一步研究表明 ,它可以在大肠杆菌中高效地启动来自于短小芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因的表达 ,也能在枯草芽孢杆菌中启动卡那霉素抗性基因的表达。     

携带大片段BIBAC克隆在不同农杆菌中的遗传稳定性研究

大片段克隆在农杆菌中的稳定性是利用可转化大片段载体进行农杆菌介导遗传转化的关键问题.选用插入片段分子质量分别为150kb和50kb的BIBAC克隆,测定了在3种农杆菌AGL-1,EHA105和LBA4404中的遗传稳定性.从第1、3、5次继代培养的农杆菌中抽提的质粒及酶切结果显示,由于农杆菌背景质粒的干扰,难以判断质粒的降解与否.将农杆菌质粒再转化到大肠杆菌宿主中,发现来自农杆菌AGL-1和EHA105的质粒出现了明显的降解,片段变小,而来自农杆菌LBA4404的质粒没有变化.结果表明,大片段BIBAC质粒在不同农杆菌菌株中的稳定性不同,在农杆菌LBA4404中比较稳定,适合用于遗传转化.     

链霉菌启动子的研究Ⅰ.灰色链霉菌启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

灰色链霉菌(streptomyces griseus)No.45是链霉素产生菌,用于工业规模的链霉素生产,其启动子结构及基因表达的调控尚未揭示。本文报道了S.riseus启动子在大肠杆菌(Escherichia coil)中的克隆和表达,证实了S.griseus中也存在E.coli类型的启动子。我们已将S.griseus DNA的PstⅠ、BglⅡ酶切片段克隆到启动子探测质粒pGA46上,在大肠杆菌中表达四环素抗性基因启动子的功能。S.griseus DNA的Hin dⅢ酶切片段也已经克隆到另一个启动子探测质粒pPV33-H上,在E.coli中表达四环素抗性基因启动子的功能。为了进一步验证和分析,将重组质粒和载体以限制性内切酶酶切,从电泳图谱中可以重新找到共同的载体区带。以DNA分子杂交的方法进行DNA同源性分析,结果表明载体pGA46或pPV33-H和S.griseus DNA没有可察觉的杂交区带,而重组质粒和S.griseus DNA及载体均有明显的杂交区带。这说明重组质粒中的外源插入序列确是来自S.griseus,这些DNA片段携带了四环素抗性基因的启动子。为了进一步分析启动子功能区域的结构,已将重组质粒No.8中4.24kb的S.griseus插入序列缩短到1.89kb。插入序列的继续缩小正在进行中。     

沈抚灌区广宿主石油烃代谢质粒的分离及鉴定

本研究采用“三亲配对外源分离法”,从沈抚灌区土壤、底泥和水样中共计分离得到8个广宿主（BHR）石油烃代谢质粒,并通过对其进行抗生素抗性检测和抗性遗传标记,将其转移至大肠杆菌(Escherichia coli)EC100宿主中进行操作.不相容性群分析结果表明: pS3-2C、pS4-6G为Inc P质粒;pS3-2G、pW22-3G、pA15-7G为Inc N质粒;pS7-2G 为Inc W质粒;pA23-1G和 pA10-1C为Inc Q质粒.采用PCR扩增已报道的石油烃污染物降解基因的方法初步分析其石油烃代谢功能,质粒pS3-2G、pS7-2G、pA23-1G、pW22-3G和pA10-1C上含有编码芳香环羟化双加氧酶基因(phdA)和甲苯单加氧酶基因(touA)的片段;pA15-7G含有编码甲苯双加氧酶和甲苯单加氧酶基因片段;pS3-2C含有编码芳香环羟化双加氧酶、苯双加氧酶和甲苯双加氧酶基因片段;pS4-6G仅含有编码芳香环羟化双加氧酶基因片段.通过宿主范围检测,除质粒pS3-2C外,其余7个质粒均可在变形菌纲(Proteobacteria)α-、β-、γ-亚纲的代表性菌株根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58、钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)JMP228、大肠杆菌EC100间进行转移并稳定传代.     

炭疽芽孢杆菌保护性抗原在大肠杆菌中的表达及纯化

按照炭疽芽孢杆菌保护性抗原（PA）基因成熟肽编码序列设计引物,从炭疽杆菌pOX1质粒中扩增出PA基因片段,将该片段定向插入到原核表达载体pET-28a中,获得了pET-PA原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为PA基因的成熟呔编码序列。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,重组蛋白在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达;Western印迹分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。     

大豆启动功能片段的克隆及在转化甘草中启动β-葡糖苷酸酶基因的表达

将大豆DNA的HindⅢ和BamHⅠ酶切片段连接到pBⅠ101载体缺启动子的GUS基因上游,构建了含有不同DNA片段的重组质粒,转化大肠杆菌C600,获得了具Km抗性的转化子。通过三亲交配将上述重组质粒转移至发根农杆菌R1000(PRiA4b)中,用注射法,将各含重组质粒的发根农杆菌菌液感染甘草外植体,在含cb的无激素MS培养基上诱发毛状根并再生成植株。转化甘草具Km抗性,有甘露碱和农杆碱存在。经组织化学法检测,在转化株C2和C13的毛根、茎、叶中有靛蓝色沉淀物产生。证明大豆启动功能片段在转化甘草中启动了GUS基因表达。重组质粒的酶切分析证明C2和C13大豆DNA插入片段均约为0.8kb。DNA分子杂交也证明C2、C13 DNA与大豆DNA和转化株DNA有同源性。     

盐生盐杆菌RM07 DNA片段在大肠杆菌中的定点诱变和启动子功能分析

将来源于嗜盐古生菌——盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)基因组的RM07 DNA片段以正反两个方向分别插入大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8携带的报告基因——氯霉素抗性基因(cat)的上游,得到RM07-cat融合的质粒pRM07-1( )和pRM07-1(-),将其分别转入大肠杆菌HB101,进而检测了不同转化子菌株的氯霉素抗性水平和细胞内氯霉素乙酰转移酶蛋白质浓度。结果表明：正向的RM07片段在真细菌(大肠杆菌)中具有启动子活性,能够驱动cat报告基因的表达;而反向的RM07片段在大肠杆菌中不具有启动子活性。对RM07片段进行了定点诱变分析,检测了特定核苷酸突变对启动子活性的影响,结果进一步精确定位了RM07片段中对在大肠杆菌中的启动子功能有重要作用的关键碱基,并且通过改造RM07片段的碱基组成成分大幅提高了其在大肠杆菌中的启动子活性。     

H-Ras结构域的原核表达及纯化

目的:克隆人H-Ras部分片段基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从质粒Myc-H-Ras中扩增H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)结构域片段,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从Myc-H-Ras质粒中分别扩增获得约500和100 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别为46×103和29×103的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189)。结论:获得了重组蛋白GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189),为后续深入研究H-Ras影响肿瘤细胞生长的机制奠定了实验基础。     

大肠杆菌启动基因的重组和表达——Ⅱ.不同启动基因对抗四环素基因表达的影响

质粒pHE5为pBR322的EcoRI—HindⅢ片段由噬菌体T4基因37的EcoRI-HindⅢ片段取代、构建而成,抗Tc基因的启动基因被破坏。在抗Tc结构基因前插入新的启动基因,可以使抗Tc功能恢复,以此可以筛选各种启动基因。我们用pHE5构建了含大肠杆菌启动基因的重组质粒800株,对它们抗四环素程度的分布作了测定,制作了重组质粒pTP210、pTP213的限制性酶切图谱,并且就应用这二个质粒作为真核基因表达运载体的可能性进行了初步讨论。