在大肠杆菌中分泌型表达人α心钠素衍生物

<正> 我们化学合成及克隆了α-ANF基因井将其重组于大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmpA进行表达;表达产物为N端多11肽的39肽α-ANF类似物,完全分泌至培养外液中;生物学活性测定表明,表达产物具有与天然心钠素相同的免疫活性及降压、利尿和舒张血管的生物活性。     

在大肠杆菌中表达可溶的多串心钠素

为获得大量的α心钠素,构建了含α心钠素多拷贝基因的重组表达载体ｐＭａｌ－ｎＡＮＰ．经ＩＰＴＧ诱导后,在Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９中稳定表达融合蛋白．优化诱导条件后,重组蛋白主要以可溶形式存在．利用ａｍｙｌｏｓｅ亲和柱初步纯化后的融合蛋白具有较好的生物学活性     

心脏分泌的激素—心钠素

心钠素（ＡＮＰ）是由心脏分泌的肽类激素，具有强烈的排钠利尿、降低血压等生理作用。在哺乳动物许多重要器官内均有心钠素的靶组织，心钠素与受体结合后，通过第二信使ｃＧＭＰ发挥生理作用。心钠素的研究具有十分重要的意义。     

人γ心钠素在大肠杆菌中的高效表达

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术扩增人γ心钠素（γ－ｈＡＮＰ）ｃＤＮＡ编码序列,在其５′和３′端分别引入ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ限制性内切酶位点,定向克隆到表达质粒载体ｐＭＳ－３１ｂ,在大肠杆菌ｐｏｐ２１３６中高效表达出人γ心钠素融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的３０～４０％。双向免疫扩散法测定证明表达产物与人α心钠素（α－ｈＡＮＰ）抗血清呈阳性反应,纯化的表达产物经复性处理后能引起大鼠胸主动脉条舒张．     

化学合成的α—降钙素基因相关基因在大肠杆菌和哺乳…

通过化学法合成α－降钙素基因相关肽的基因,该基因５＇端有ＢａｍＨ Ｉ切点和启始密码,３＇端有ＤａｌＩ切点和终止密码。为了表达这一基因,组建表达载体ｐＸＺ６２．这一表达载体具有Ｔｒｅ启动子,含有Ａｐ＾ｒ和ＸｙＬＥ基因。α－降钙素基因相关肽基因与ｐＸＺ６２边接,构建重组质粒ｐＸＺ１０１;并将该基因与质粒ｐＨβＡＰｒ－３Ｐ－ｎｅｏ连接,构建重组质粒ｐＸＺ２０１．将重组质粒分别转化到大肠矸菌和ＨｅＬａ细胞     

基因工程人α心钠素发酵研究

本研究采用的基因工程菌为酵母Y33：：YFD71－3,其基因型为α,his,1eu,ade,suc．摇瓶培养时心钠素的表达水平为l～2rag／L。在含有葡萄糖、YNB以及不同量腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的YG培养基中作摇瓶培养．当细胞的生长由腺嘌呤限制时,蛋白的分泌有明显增加·在YG培养基中加入5g／L的CAA后腺嘌呤成为限制性基质,培养基中腺嘌呤、YNB和亮氪酸用量对心钠素的表达有很大影响。在5L反应器中进行补料分批培养,流加葡萄糖、YNB、cAA、腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸,心钠素的最高浓度达到24．8mg／L。     

芝田硫化叶菌新型α-淀粉酶基因在大肠杆菌的克隆和表达

A novel α-amylase gene was amplified from Sulfolobus shibatae by using PCR technique.The amplified 1.7kb DNA fragment was inserted into an expression vector pBV220 to yield the recombinant plasmid pSBAM. The novel α-amylase gene in pSBAM was expressed in E. coli. The production of the novel α-amylase activity reached over 8 units/100mL of the culture. The molecular weight of this enzyme was about 61kD by SDS-PAGE. The expressed novel α-amylase protein in E.coli DHSα accounted for about 20 % of the total protein in the recombinant cell. The cooperative action of the novel α-amylase and the maltooligosyltrehalose synthase from Sulfolobus shibatae was investigated and trehalose was detected by using HPLC analysis when using amylose and partial starch hydrolysates as substrates.     

人α-心钠素全基因的化学合成

用固相亚磷酰胺法(solid-phase phosphoramidite method)合成了人α-心钠素(简称α-hANP)的全基因。合成的α-hANP基因全长为96bp,包括编码α-hANP的结构基因、基因5＇端的谷氨酸(作为表达产物用内肽酶Glu-C专一裂解的位点)密码子GAA、基因3＇端的终止信号TGA及基因两端的接头部分。基因分7个寡聚核苷酸片段在DNA合成仪上合成,然后一次性酶促连接成为完整的α—hANP双链基因。化学合成的基因克隆到M13载体上,经分子杂交鉴定筛选出的α-hANP基因克隆株,用双脱氧链终止法进行序列分析,证明核苷酸顺序正确。     

心钠素在强啡肽降压效应中的作用

前已报道,吗啡能刺激心钠素的释放。本文报告,静注强啡肽可引起大鼠血压的降低,这一作用可为纳洛酮和抗心钠素IgG预处理所阻断。静注强啡肽可引起大鼠血浆中心钠素水平升高和心房心钠素的下降。实验结果提示,强啡肽的降压效应可能由心房中心钠素释放所致。     

心钠素在GABA调节下丘脑正中隆起LHRH释放的介导作用研究

已证明脑神经递质GABA可促进下丘脑正中隆起LHRH神经元末梢的释放功能,这一作用可能通过抑制某些抑制性神经递质或调质释放而实现。本研究旨在观察作为体内循环调节肽的心钠素在大鼠脑内的分布,对LHRH释放的影响及对GABA调节LHRH释放的中介作用。实验结果发现:(1)雄性大鼠不同脑区心钠素的含量不同,其中以下丘脑正中隆起组织含量最高;(2)不同浓度的心钠素(10~(-8)-10~(-6)mol/L)可显著抑制LHRH从下丘脑正中隆起释放,并呈现剂量反应关系。(3)GABA(10~(-6)mol/L组)可显著抑制心钠素的释放;GABA的这一抑制作用可被GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱(Bicuculline)完全反转。上述结果提示心钠素参与调节下丘脑正中隆起(ME)LHRH神经元末梢的释放机能,它亦可能介导GABA对下丘脑正中隆起LHRH的调节作用。     

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变。将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIFNα-2b基因融合并于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入合适的酶切位点。融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子。融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。     

人溶菌酶基因的合成和克隆

用固相亚磷酰胺法合成了人溶菌酶的全基因,全长为409bp,它包括了编码人溶菌酶的结梅基因,起始密码于ATG,终止密码子TAA、TGA,以及两端的BamHI和SphI的识别顺序。整个基因分成24个寡聚核苷酸片段进行合成,每个片段长度分别为26至38个核苷酸．然后用两种方法酶促连接成完整的人溶菌酶基因。基因克隆到M13载体上。用点杂交和限制酶酶切分析确定阳性克隆株。用双脱氧链终止法进行序列分析,证实所合成的人溶菌酶基因序列与设计的完全一致。     

Taq DNA耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高表达

从水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1中分离得到的Taq DNA 聚合酶是一种广泛应用于PCR的耐热DNA聚合酶。由于天然菌株酶产量较低,培养条件要求严格,酶的纯化过程极为繁琐而使产品成本较高,因而促使人们构建适合于大规模生产的基因工程菌株。已有人分别通过不同的途径,使用不同的载体,成功地在大肠杆菌菌株中表达了Taq 耐热DNA聚合酶基因。我们通过与前人不同的途径,把这一基因克隆到大肠杆菌的载体质粒pJLA503上并使其得以高表达,为降低生产成本和进一步研究该酶的各种特性提供了有利条件。     

基因定点诱变删除及天然α型心钠素的分泌型表达

用基因定点诱变技术,删除了pO_1α ANF表达质粒中的33对碱基,使人α型心钠素结构基因直接与大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmPA中的信号肽酶切位点编码区相连,构成天然人α型心钠素的表达质粒pANF,在IPTG诱导下表达28肽的天然人α型心钠素。纯化后的表达产物具有天然心钠素的放免活性和很强的舒张血管的生物活性。     

α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆及在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体,以Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９为受体,构建了含α－乙酰乳酸脱羧酶（α－ＡＬＤＣ）基因的地衣芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＳ１０１０６的基因文库,得到４８００个重组转化子中均含有４～１０ｋｂ的外源插入ＤＮＡ片段,从基因文库中筛选到６个阳性克隆,对其中１个克隆的α－乙酰乳酸脱羧酶基因片段进行亚克隆分析表明,该α－乙酰乳酸脱羧酶基因位于１．６ｋｂ的ＢａｍＨⅠ