绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5个 cDNA及其下游非编码区

通过3'RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP)Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemmin Ⅰ～Ⅴ及其下游非编码区(3′untranslated region,3′UTR).它们的编码区长度除gynostemmin Ⅱ为825 bp外,其余均为831 bp.其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171 bp.在3′UTR中,gynostemmin Ⅰ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件,其mRNA的稳定性可能因此受到影响.     

猪内源性反转录病毒5'端非编码区的克隆及结构分析

通过五指山猪内源性反转录病毒5'端非编码区(5'UTR)cDNA的克隆,分析其一级结构和调控元件,为进一步研究其在PERV复制、转录中的调控机制奠定基础.本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长约1035bp的PERV 5'UTR.通过NCBI公共数据库BLASTn序列进行同源性分析,并应用KEGG数据库对该转录调控区进行顺式作用元件定位分析,结果发现PERV 5'UTR与GenBank公布的部分PERV 5'UTR相比较,同源性在82.6～94.8%之间.一级结构分析发现PERV 5'UTR由U3、R、U5区、引物结合区(PBS)及前导序列组成,可能的核心启动子序列与具有增强子作用的39bp重复序列分别位于U3区的-67～+1与-97～-59区段.在5'UTR转录调控区(-428～+507)鉴定出31个有效的顺式作用元件位点,其中NF-Y、TBP、Oct-1、HSF、GATA-1和GATA-2等与PERV的转录、调控密切相关.     

球根白丝膜菌γ-actin基因的克隆及表达分析

根据真菌肌动蛋白(actin)基因保守区序列设计引物,用简并PCR法和RACE技术分离得到球根白丝膜菌(Leucocortinarius bulbiger)γ-肌动蛋白基因(Lb-act)的全长cDNA序列。该序列全长为1 357 bp,包含一个1 137 bp的开放阅读框(ORF),编码378个氨基酸,5'端非翻译区(5'UTR)92 bp,3'UTR长度128 bp。Port Param软件在线分析结果表明,该cDNA所编码的蛋白质理论等电点为5.12,相对分子质量为95.022 kD,具有真菌γ-actin基因3个保守特征序列。Blast同源性检索结果表明,Lb-act氨基酸序列与担子菌肌动蛋白序列有较高的相似性,其与双色蜡蘑的肌动蛋白氨基酸序列的亲缘关系最近。Lb-act基因在不同碳源及磷水平培养条件下表达量基本一致,验证了该基因作为分子内标的可靠性。     

亚洲玉米螟的O-β-N-氨基乙酰葡萄糖基水解酶 (OfOGA)的基因克隆及重组表达

O-GlcNAc修饰作用是一种普遍存在的动态可逆的糖基化修饰作用,由O-GlcNAc转移酶(OGT)与O-GlcNAc水解酶(OGA)负责调控。以亚洲玉米螟5龄幼虫为对象,克隆获得了全长O-GlcNAc水解酶(OfOGA)基因,其长度为3 541bp,其中5’-非编码区的长度为241bp,编码区的长度为3 165bp,3’-非编码区的长度为132bp;实现了OfOGA在原核表达载体中的重组表达。重组OfOGA由1 055个氨基酸构成,理论分子量118kDa,但SDS-PAGE电泳显示其实际分子量为130kDa。重组OfOGA的最适pH为5.5,最适温度为50℃。亚洲玉米螟OfOGA基因的获得与表达有助于理解OGA在昆虫生长发育中的作用,提供可能的生物防治靶标。     

柞蚕14-3-3基因的鉴定及表达分析

14-3-3蛋白是一种可以改变其结合蛋白构象的酸性蛋白质.柞蚕14-3-3 cDNA序列全长1 220 bp,包括一个126 bp的5'非编码区和一个350 bp的3'非编码区.该基因的开放读码框长度为744 bp,编码247个氨基酸.序列比对结果表明,柞蚕14-3-3蛋白与家蚕的14-3-3蛋白具有高度同源性.此外对柞蚕14-3-3基因进行了原核表达和重组蛋白纯化.SDS-PAGE和免疫印迹结果表明,分子量大小约32 kD的重组蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达.     

一种改良的克隆小麦GLP3基因启动子的TAIL-PCR技术

以小麦基因组DNA为模板,用一种改良热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)技术克隆到全长为1748bp的小麦GLP3基因的上游侧翼序列。测序结果表明,TATA-box位于基因转录起始位点CAT-box上游-27bp处;CAAT-box位于CAT-box上游-163bp处;ATG位于CAT-box下游94bp处,5'UTR(非编码区)序列全长93bp,表明该序列为小麦GLP3启动子序列。     

马氏珠母贝Caspase-3基因克隆和组织表达分析

半胱氨酸蛋白酶3 (Caspase-3)作为细胞凋亡通路中重要的效应蛋白,在细胞凋亡过程中发挥着重要作用.为初步探究马氏珠母贝Caspase-3(PmCaspase-3)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmCaspase-3基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法分析了PmCaspase-3基因mRNA在马氏珠母贝不同组织和不同发育时期的表达差异.结果 显示,PmCaspase-3基因cDNA全长为2233 bp,其中5'端非编码区长度为80 bp,3'端非编码长度为31 bp,开放阅读框长度为2088 bp,共编码695个氨基酸;生物信息学分析显示,PmCaspase-3含有Caspase家族特有的CASc结构域和半胱氨酸蛋白酶家族p20、p10活性位点以及多种磷酸化位点,经进化分析以及多序列比对可知与其他物种Caspase-3蛋白同源性较高.RT-qPCR结果表明,PmCaspase-3在肝胰腺中的表达量最高,在闭壳肌中的表达量最低;在发育过程中D型幼虫期和眼点期的表达量较高.     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株3'端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3'端非编码区(3'UTR)的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3'UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3'UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3'UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低(54.4%～75.5%);3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3'UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。     

牡丹PsCS基因的克隆及序列分析

以牡丹品种‘赵粉’(Paeonia suffruticosa L.cv.‘Zhao Fen’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从雄蕊中获得了一个牡丹柠檬酸合成醇(citrate synthase,CS)基因cDNA全长,命名为PsCS,GenBank登录号为HQ449568.其cDNA全长1 564 bp,包含75 bp的5’非编码区、73 bp的3 '非编码区和一个长度为1 416 bp编码471个氨基酸的开放阅读框.序列比对和系统进化分析表明,PsCS与葡萄的亲缘关系最近,相似性达89.4％以上.     

斑点叉尾鮰巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因多态性及表达分析

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一类主要由T细胞产生、负责机体在环境协迫和炎症反应中进行免疫应答的细胞因子。根据斑点叉尾鮰MIF基因EST序列,应用RACE技术克隆了MIF 3'UTR和5'UTR序列,利用Genome Walking技术克隆了MIF启动子序列,通过特异PCR克隆MIF内含子序列,并对多个体MIF基因组序列进行多态性分析,利用荧光定量PCR研究MIF的组织分布。结果显示,斑点叉尾鮰MIF基因组序列共3 918 bp,其中编码区348 bp,编码115个氨基酸,5'UTR为70 bp,3'UTR为434 bp,启动子为1 382 bp,共有2个内含子,分别为243 bp和1 441 bp。MIF基因组序列中包含4个重复单元序列和60个多态性位点,其中共有6个SNP位于转录因子结合位点上。斑点叉尾鮰MIF mRNA在肠中表达量最高,肌肉中表达量最低。     

利用染色体步移PCR检测辐射松的单核苷酸多态性

用染色体步移技术(chromosome walking)的基本原理以辐射松(Pinus radiata)肌动蛋白基因(actin)为例,利用获得的EST序列设计定向引物,向上游和下游进行了染色体序列的步移.获得了包括启动子、5′端非编码区和编码区及3′端非编码区辐射松肌动蛋白基因基因组序列2154 bp.通过对200株不同辐射松个体进行PCR扩增及测序,共获得了21个SNPs,其中启动子区域3个,编码区15个,3′端非编码区4个.实验结果为今后染色体步移技术在基因非编码区SNP的检测提供了理论与技术参考.     

紫杆柽柳与其它物种脂质转运蛋白基因编码蛋白的同源性比较

根据从柽柳cDNA文库克隆获得的脂质转运蛋白(LTP)的部分序列,用RACE技术克隆出其全长cDNA序列.基因的5'非翻译区96bp,3'非翻译区222bp,开放阅读框285bp,编码94个氨基酸,预计蛋白的分子量为9.9 kD,等电点为8.02.此基因有8个位置保守的Cys残基及26个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY574218(基因)和AAS79106(蛋白).     

小花草玉梅正常和自然变异植株的AP3-3基因研究

野生小花草玉梅(Anemone rivularis var.flore-minore)正常植株和花被片自然变异植株的外观形态差异很大,该研究以二者为材料,利用常规PCR和高效热不对称PCR(Hi-Tail PCR)技术从其正常和变异植株的基因组中各分离得到1个B类基因。序列分析证明,二者隶属于B类MADS-box基因AP3家族的旁系同源基因AP3-3分枝,分别命名为NArAP3-3(正常植株)和VArAP3-3(变异植株)。NArAP3-3基因全长3 795bp,VArAP3-3基因全长3 898bp,二者均含有1个666bp的开放阅读框(ORF),可编码221个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,其编码肽链包含了MADS区、K区、Ⅰ区和C区。对比NArAP3-3和VArAP3-3基因的全长序列,发现VArAP3-3基因比NArAP3-3多了1段49bp的插入,且在ORF序列与NArAP3-3基因相比有4个碱基突变。对二者的全长序列、所编码的221个氨基酸及插入序列的生物信息学分析显示,二者在基因启动子、蛋白质基本性质、结构功能域、二级三级预测结构等方面均有差异,推测这些差异可能是花被片变异产生的原因之一。该研究结果为进一步探索其变异机制奠定了基础。     

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)细胞粘附分子3(Pm-CAM3)基因的克隆与表达分析

细胞粘附分子3 (cell adhesion molecule 3, CAM3)是免疫球蛋白家族(immunoglobulin family, IgSF)的一员,在细胞黏连、外源病原体的识别等方面具有重要作用。本实验利用末端快速克隆(RACE)技术,克隆获得马氏珠母贝(Pinctada facata martensii)细胞粘附分子3的全长序列(Pm-CAM3),并使用荧光定量PCR(Real-time PCR, q RT-PCR)技术检测了Pm-CAM3在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。结果显示,Pm-CAM3基因全长2 245 bp。其中5'UTR 335 bp,3'UTR 166 bp,开放阅读框(ORF)长度为1 744 bp,共编码581个氨基酸;预测其相对分子量为63.21 kD,等电点为5.07,脂溶指数(aliphatic index)为67.21;总平均亲水性(grand averageofhydropathy, GRAVY)为-0.549,属于亲水性蛋白;Pm-CAM3具有跨膜结构域,其胞外区域具有一个Ig SF家族典型的Ig结构域以及一个Ig-like结构域。多序列比对结果显示,Pm-CAM3在物种间的保守性较低,其中Pm-CAM3与太平洋牡蛎的CAM3 (Crassostrea gigas, Cg-CAM3)的氨基酸序列相似性最高,但仅为37%。qRT-PCR分析表明Pm-CAM3在马氏珠母贝的9个组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高(p<0.05)。     

扩展青霉PF898碱性脂肪酶基因组DNA的克隆及序列分析

扩展青霉 (Penicilliumexpansum)PF898可产生一种具有重要工业生产价值的碱性脂肪酶(PEL) .在通过 3′RACE和 5′RACE获得PEL完整的cDNA序列的基础上 ,通过PCR方法首次克隆了该脂肪酶的完整的基因组DNA序列 (GenBank登录号为AF330 6 35 ) .该脂肪酶DNA全长 14 0 4bp ,包括PEL编码区、3′非翻译区和部分 5′非翻译区基因的序列 .编码区DNA由 1135个碱基组成 ,含有 5个内含子 ,大小分别为 5 8bp、4 7bp、5 0bp、5 6bp和 6 9bp .在已报道的丝状真菌脂肪酶中 ,PEL基因的内含子数量最多 ,而其大小与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子一样 ,均为只有几十个碱基的小内含子 .PCR扩增获得的PLEDNA序列还包括由 195个碱基组成的 3′端非编码区序列 ,74个碱基的部分 5′端非编码区序列 .PELDNA全长序列中的 - 2 4至 - 2 7nt为TATAbox ,终止码TGA下游15 6nt出现AATAAA序列 ,TGA下游 182位出现poly(A)尾 ,为典型的真核基因结构 .同源性序列分析表明 ,PEL与其它真菌来源脂肪酶的基因组DNA序列同源性约为 39%～ 4 9% ,PEL内含子之间或PEL内含子与其它丝状真菌脂肪酶基因的内含子之间的序列同源性约 4 2 %～ 5 7% .     

马氏珠母贝STA RDL3基因的克隆与表达性分析

采用RACE技术克隆获得马氏珠母贝STARDL3基因c DNA全长序列(Pm-STARDL3);利用荧光定量技术检测Pm-STARDL3基因在各个组织中的表达量。结果表明,Pm-STARDL3基因c DNA序列全长3 655 bp,开放阅读框(ORF)长1 491 bp,编码496个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长110 bp,3'UTR长2 054 bp。PmSTARDL3氨基酸序列同源比对分析显示与华贵类栉孔扇贝(Mimachlamys nobilis)STARDL3的序列的相似度最高。SMART软件分析得出,Pm-STARDL3有STARD类蛋白特有的结构域。荧光定量PCR检测结果表明Pm-STARDL3在肝胰腺中表达量最高,其后依次是外套膜、鳃与闭壳肌,各组织的表达量差异具统计学意义(p0.05)。     

马氏珠母贝TRA F7基因cDNA的克隆及表达分析

肿瘤坏死因子受体相关因子7(TRA F7)属于TRAFs家族,参与多种免疫炎症反应。为了研究马氏珠母贝TRAF7(PmTRA F7)的生物学功能,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmTRA F7基因cDNA的全长序列并对其序列特征进行分析;同时利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了马氏珠母贝不同组织中PmTRA F7基因mRNA的表达。结果显示,PmTRA F7基因cDNA全长2246bp,开放阅读框(ORF)1809bp,编码602个氨基酸,5'非翻译区(5'UTR)长211bp,3'非翻译区(3'UTR)长226bp,预测分子量约为67.50kD,理论等电点为6.56。多序列比对结果发现软体动物间TRA F7具有高保守性。软件分析结果显示PmTRA F7的氨基酸序列具有典型的RING结构、锌指结构和7个重复的WD40序列。荧光定量数据分析表明,PmTRA F7基因在全组织中均有表达,在肝胰腺中表达量最高,外套膜和鳃中表达量也较高。     

甜菜NADH-NR基因的克隆和序列分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜品种甜研7号(Ty7)中获得氯素诱导NADH-NR基因片段,通过RACE技术克隆NADH-NR基因全长序列.该基因ORF长度2 718 bp,编码905个氨基酸,包括147 bp的5'UTR和382 bp的3' UTR,GenBank上的注册号为EU163265,基因编码蛋白的等电点为6.12,推测分子量大小为102 kD,C端(778-891 aa)有一个跨膜区域.基因编码多肽含有3个氧化还原功能区:钼辅因子功能区(eukary NR Moco,93 - 478aa),Fe-血红素结合区(Cytb5,535 -608 aa),FAD结合区(FAD binding 6,653 -760 aa).在甜研7号NR下游的氨基酸残基中含有NADH-NR特有的CGPPP-M基序,说明该蛋白以NADH为电子供体.通过比对,甜研7号的NADH-NR基因与菠菜NADH-NR基因同源性最高,为86.18％.经Southem杂变检验,甜研7号中NADH-NR基因以低拷贝数存在.经基因组克隆分析,甜研7号NADH-NR含有3个内含子,4个外显子.     

家蚕全基因组微卫星分布规律及其生物信息学分析

本研究利用MSDB v2.4软件以及生物信息学方法获取了家蚕全基因组的完整型SSRs序列,并对其分布规律进行比较分析。家蚕全基因组中SSRs总数量为141 311个,相对丰度为209.01 No/Mb,总长度为2.41 Mb,全基因组SSRs六种碱基重复类型的数量和密度分布模式为:单碱基四碱基三碱基二碱基五碱基六碱基,说明全基因以单碱基为主要碱基类型,六种碱基类型中五碱基SSRs G-C含量最高。对全基因组3'非翻译区(3'UTR)、5'非翻译区(5'UTR)、编码区(CDs)、内含子区(Introns)和基因间隔区(Intergenics)等不同区域SSRs分析表明,Introns区SSRs数量最高,为125 178个,最小的是5'UTR,为278个,其数量大小顺序为IntronsIntergenics3'UTRCDs5'UTR。5个不同区域的SSRs的碱基的总计数差异较大,编码区总计数最大的是三碱基,而其他4个区域最多的是单碱基。分别对5个区域SSRs中六种重复拷贝类别进行统计分析,碱基总计数(或频率)最多的分别是A;AC、AG、AT;AAT、CCG;AAAT、AAAC;AAATC、AAACT和TAAGTT、GAATTT、AATTAA,Introns和Intergenics区的重复类型总计数显著高于3'UTR、CDs和5'UTR。各重复类型拷贝数分布范围为4～100,主要集中在4～30之间。这为进一步系统分析家蚕SSRs分子标记筛选和遗传分析打下基础。     

棉铃虫核多角体病毒lef—3基因的序列分析

在棉铃虫核多角体病毒 (HelicoverpaarmigeraSingle nucleocapsidNucleopolyhedrovirus ,HaSNPV)基因组中发现了lef 3基因 ,该基因位于病毒基因组的BamHⅠ F片段上 ,全长 114 0bp ,编码 379个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 4 4kD ,启动子区具有TATAbox ,位于起始密码子ATG上游 4 0～ 4 3nt处 ,在终止密码子下游具典型的 poly(A)终止信号AATAAA。并且在它的氨基酸序列的N -端也具有一个类似SSB保守序列的基元结构