拟南芥cDNA芯片和油菜-拟南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因

以拟南芥cDNA芯片筛选核盘菌侵染时甘蓝型油菜的局部抗(耐)病相关基因, 共获得在病斑周围局部组织中受核盘菌胁迫后表达变化达2倍以上的基因61个. 这些基因中, 36个基因为上升表达, 25个基因为下降表达. RT-PCR和Northern杂交验证了部分芯片杂交筛选的结果, 表明拟南芥cDNA芯片可用于甘蓝型油菜基因转录谱的研究. 结合油菜-拟南芥基因组比较作图, 将一些cDNA芯片筛选得到的油菜菌核病抗性相关基因定位于甘蓝型油菜抗菌核病QTL区间内. 取定位于QTL峰值区域的少数基因为先验基因, 值得优先对这些基因进行深入研究.     

甘蓝型油菜BnCOP1基因编码区全长cDNA的克隆与功能研究

通过分析拟南芥、豌豆、番茄和水稻的COP1 (constitutively photomorphogenic 1) 的cDNA序列, 运用RT-PCR和改进的基因组步行 (genome walking) 技术相结合的方法, 首次从甘蓝型油菜中克隆到油菜 BnCOP1编码区cDNA的全长序列, 其全长2 034 bp, 编码677个氨基酸. 同源 性分析表明, 其编码的氨基酸序列与拟南芥的同源性高达94%. 对BnCOP1编 码序列（cDNA）演绎出的氨基酸序列分析表明, 其编码的蛋白包含有N端的 环形锌指结合域(ring finger zinc binding domain, RING)、中间的卷曲 螺旋形结构域(coiled-coil domain, coiled-coil ), 7个C端的WD-40重复 序列(WD-40 repeats, WD-40)的功能域. 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 分析该基因在油菜中的表达模式,结果显示, BnCOP1在甘蓝型油菜的各个组 织器官中均有表达,其中在花中的表达明显高于在根、叶、茎、果荚及子叶 和胚轴中,暗示该蛋白可能与开花途径相关. 过表达BnCOP1的转基因拟南芥 植株在高度、主茎的直径和叶片大小上都呈现出比野生型弱小的表型, 表 明BnCOP1抑制了拟南芥光形态建成从而影响了植物的生长发育.     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。     

甘蓝型油菜中一类AP2/ERF转录因子的克隆和生物信息学分析

AP2/ERF转录因子家族是植物中广泛存在的一类转录因子,AP2/ERF这类转录因子主要参与植物的细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因的表达调控。由于拟南芥和油菜同属于芸薹属,具有相似的基因信息,利用油菜UniGene数据库,以拟南芥ERF转录因子保守序列为探针,通过电子克隆从一个UniGene Cluster中分离得到三个同类的AP2/ERF转录因子,从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性分析、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构、无序化特性进行了预测和较为全面的分析。结果显示油菜来源的BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3属于AP2/ERF转录因子的B-2亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtERF1相似。蛋白质无序化分析发现,油菜BnaERF1、BnaERF2和BnaERF3无序化程度小于拟南芥AtERF1。设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型双低油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中扩增了上述基因,初步分析BnaERF2没有内含子,BnaERF1和BnaERF3有内含子。另外,通过EST丰度分析显示,该类转录因子的表达最高峰在种子中,其次为花,在芽、茎和分生组织中没有检测出表达的存在。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

油菜矮秆突变WRKY转录因子cDNA克隆及表达分析

以甘蓝型油菜为材料,利用已建立的抑制性消减文库(SSH),采用RACE技术克隆到1个植物WRKY转录因子相关基因,命名为BnD11,其cDNA全长1034 bp,含有810 bp的完整开放阅读框,编码269个氨基酸。该基因编码的氨基酸序列与拟南芥WRKY40氨基酸序列相似性为79%,与拟南芥中编码WRKY-DNA结合蛋白40基因的氨基酸序列相似性达78%,与其它多种植物的WRKY转录因子的氨基酸序列也有较高的相似性。半定量RT-PCR对BnD11进行组织特异性表达分析显示:在正常生长条件下,BnD11在野生型和矮秆油菜的各个组织中均有表达,但在矮秆突变的根、茎、茎尖的相对表达量明显高于野生型。研究表明,BnD11功能区段具有很高的保守性,可能参与了油菜的茎秆发育。     

拟南芥F-box基因At3g16740的表达分析

拟南芥At3g16740基因为F-box基因家族成员,其功能尚不清楚.通过连续和瞬时光照处理分析,发现蓝光、红光和远红光都诱导At3g16740基因的表达,其中远红光的诱导作用最明显.蓝光受体cry1、cry2,红光受体phyB或远红光受体phyA突变导致At3g16740基因表达的光诱导作用减弱或者消失,表明该基因为光信号通路相关基因.通过实时荧光定量PCR分析At3g16740基因在拟南芥不同组织器官中的表达,发现其在拟南芥根、茎、叶、花和果荚中都有表达,花和果荚中的表达量最高,推测该基因可能参与植物花和/或果荚的发育.酵母双杂交分析发现,At3g16740蛋白通过F-box结构域与拟南芥ASK(arabidopsis-SKP1-like)家族成员ASK1、ASK2和ASK11相互作用,表明At3g16740是SCF(Skp、Cullin、F-box)复合物的成员.     

油菜BnHMGB2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的BnHMGB2基因的cDNA,全长823 bp,其中包括438 bp的开放阅读框,131 bp的5′非翻译区（5′UTR）,253 bp的3′非翻译区（3′UTR）。与拟南芥AtHMGB2的同源性达到了87.4%,因此命名为BnHMGB2(GenBank登录号：JN807314)。该基因编码145个氨基酸的蛋白质,分子量15.9 KDa,等电点为5.63。实时荧光定量PCR结果表明该基因在油菜根、茎、叶、下胚轴均有表达,根中表达量最高。同时,该基因的表达受低温胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

独行菜LaAP2基因克隆、生物信息学分析及表达分析

AP2/ERF是广泛存在于植物中一类重要的转录因子,调控一些参与非生物胁迫相关基因的表达,帮助植物提高逆境胁迫能力。为了深入探讨LaAP2在独行菜耐受低温萌发及幼苗耐受低温生长中的功能,该研究基于前期对独行菜(Lepidium apetalum)转录组数据库分析,克隆获得一个显著上调表达的AP2/ERF家族序列LaAP2。该基因cDNA全长为1 005 bp,编码氨基酸序列包含一个AP2和一个B3结构域,属于AP2/ERF转录因子RAV亚家族。推定的LaAP2蛋白分子量为37.744 67 kD,等电点为9.49。该蛋白氨基酸序列同亚麻荠、拟南芥、油菜等物种显示出较高同源性,系统进化分析结果表明与拟南芥亲缘关系较近。氨基酸序列分析预测表明,LaAP2基因所编码的蛋白不具备信号肽区段,无跨膜区,不属于分泌蛋白,可能为亲水性蛋白;定位于细胞质的可能性为56.5%,定位于细胞核的可能性为21.7%;其主要二级结构元件为无规则卷曲、延伸链、α-螺旋。Real-time PCR分析独行菜幼苗中LaAP2在低温4℃处理下的表达,显示LaAP2表达受低温胁迫呈先下降后升高趋势。这表明LaAP2在独行菜幼苗抵抗低温胁迫中起调控作用。     

油菜AP2/ERF-B4类转录因子克隆及表达载体的构建

利用油菜UniGene数据库,以拟南芥转录因子保守序列为探针,通过电子克隆方法分离得到一个UniGene库Bna.17538,进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族的转录因子BnaERFB4-1,长度为672 bp,并进行了相关的生物信息学分析.结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因,命名为BnaERFB4-1-Hy15.序列测定和分析显示,来源于沪油15的BnaERFB4-1-Hy15基因与电子克隆的基因序列差异很小,有3个氨基酸位点不同,存在一个内含子.将BnaERFB4-1-Hy15基因通过BamHⅠ和SacⅠ酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404的相应位置,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.     

油菜糖基转移酶BnIRX14基因家族鉴定及遗传转化

糖基转移酶在植物抗逆和发育调控中发挥着重要作用,为发掘糖基转移酶BnIRX14基因家族成员,解析在甘蓝型油菜中的生物学功能,该研究利用前期在甘蓝型油菜中克隆到的BnIRX14基因,采用序列比对和遗传转化的方法,进行BnIRX14基因家族成员鉴定和功能验证,以探讨BnIRX14基因家族在油菜发育中调控机理,为油菜杂交育种和抗逆育种提供理论依据。结果表明：(1)经基因组数据库比对分析在甘蓝型油菜中成功鉴定到3个糖基转移酶不同亚家族的11个BnIRX14家族成员,它们均具有糖基转移酶GT43家族成员结构域特征,其中有8个基因分别被定位在6条不同染色体上,3个亚家族在基因结构和保守元件中具有较大特异性。(2)利用农杆菌介导转化法,获得BnIRX14基因RNA干扰转基因油菜株系20株,经PCR检测,确定5株阳性转化体。(3)表型鉴定发现,有2株阳性转化株的花柱头至花柱中央为一孔状空腔,子房较野生型明显膨大,且柱头表面授粉后不能结实,表现雌性不育;其他3个阳性株花器结构发育正常,但植株茎、枝表皮有液体渗出,呈露珠状粘附在茎、枝表面。(4)实时荧光定量PCR分析显示,转BnIRX14基因油菜阳性植株...     

The Brassica napus extA extensin gene is expressed in regions of the plant subject to tensile stresses

The expression of extA, an extensin gene from Brassica napus L. (oilseed rape) was examined in transgenic Nicotiana tabacum L. (tobacco) and untransformed Brassica juncea L. and B. napus tissues. Northern analysis showed that this gene maintained its normal pattern of expression when transferred to tobacco. In transgenic tobacco plants containing an extA promoter/-glucuronidase coding sequence fusion, expression of extA was detected in the external and internal phloem of the main stem. High expression levels were seen in cortical parenchyma cells at the point where the axillary flowering branch joined the main stem. Expression was greatest in regions where the maximum tensile stress would seem to be exerted on the main stem by the weight of the axillary branch. It was confirmed that this expression pattern was due to tensile stress by using weights to induce expression of the fusion gene in axillary flowering stalks. In B. juncea pods, in-situ hybridisation studies showed that the extensin gene was strongly expressed in cells of the carpel walls within which considerable tensile stresses develop.Abbreviations GUS -glucuronidase - X-GLUC 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide - SSC saline sodium citrate We thank the Biotechnology and Biological Sciences Research Council for funding this research, and Mrs. W. Grail for her expertise in histochemical technique. Ms. J. Spence is the recipient of a Biotechnology and Biological Sciences Research Council post-graduate studentship award.     

Intergeneric hybridization between Brassica napus and Sinapis pubescens,and the cytology and crossability of their progenies

The cytological possibility of gene transfer from Sinapis pubescens to Brassica napus was investigated. Intergeneric hybrids between Brassica napus (2n = 38) and Sinapis pubescens (2n = 18) were produced through ovary culture. The F₁ hybrids were dihaploid and the chromosome configurations were (0–1) _III + (2–11) _II + (5–24) _I . One F₂ plant with 38 chromosomes was obtained from open pollination of the F₁ hybrid. Thirty-one seeds were obtained from the backcross of the F₂ plant with B. napus. Five out of seven plants had 38 chromosomes, and the pollen stainability ranged from 0% to 81.4%. In the B₂ plants obtained from the backcross of B₁ plants with B. napus, 66.7% of the plants examined had 38 chromosomes. S. pubescens may become a gene source for the improvement of B. napus.     

甘蓝型油菜PGK基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜磷酸甘油酸激酶(PGK)基因表达特性,在对拟南芥PGK基因家族生物信息学分析的基础上,通过电子克隆方法获得3个甘蓝型油菜PGK基因(BnPGK1、BnPGK2、BnPGK3)。分别设计特异引物,以甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的cDNA为模板克隆BnPGK基因全长序列。根据获得的cDNA序列设计实时荧光定量特异引物,采用实时荧光定量PCR技术,研究油菜雄性不育系与保持系PGK基因表达差异。结果显示:BnPGK基因在甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的根、茎、叶、花蕾中均有表达,属组成性表达。除茎中的BnPGK3外,BnPGK其它基因在根、茎、叶中的表达均表现为09A高于09B,而在花蕾中均为09B高于09A,BnPGK1和BnPGK3在09B中的表达量是09A中的2倍以上。     

Sequence,expression divergence,and complementation of homologous <Emphasis Type="Italic">ALCATRAZ</Emphasis> loci in <Emphasis Type="Italic">Brassica napus</Emphasis>

The genomic era provides new perspectives in understanding polyploidy evolution, mostly on the genome-wide scale. In this paper, we show the sequence and expression divergence between the homologous ALCATRAZ (ALC) loci in Brassica napus, responsible for silique dehiscence. We cloned two homologous ALC loci, namely BnaC.ALC.a and BnaA.ALC.a in B. napus. Driven by the 35S promoter, both the loci complemented to the alc mutation of Arabidopsis thaliana, yet only the expression of BnaC.ALC.a was detectable in the siliques of B. napus. Sequence alignment indicated that BnaC.ALC.a and BolC.ALC.a, or BnaA.ALC.a and BraA.ALC.a, possess a high level of similarity. The understanding of the sequence and expression divergence among homologous loci of a gene is of due importance for an effective gene manipulation and TILLING (or ECOTILLING) analysis for the allelic DNA variation at a given locus. S. Hua and I. H. Shamsi contributed equally to this work.