合成生物学中不依赖限制性内切酶的分子克隆策略

随着合成生物学的兴起和发展,基因克隆和DNA大片段组装成为了常规操作。利用人工智能和液体操作机器人进行高通量的DNA组装和功能筛选已被广泛应用。传统的依赖于限制性内切酶识别位点的克隆技术对序列有选择性、步骤繁琐、实验人员的培训周期长,不利于以流水线形式进行工程化使用,已经逐步在生物工程领域内被淘汰。文中论述了一系列适于机械化操作的新一代分子克隆技术,即不依赖基因序列和连接反应克隆方法、Gibson组装、聚合酶环形延伸克隆、细胞裂解物体外无痕连接和细胞体内组装克隆。对这些方法的建立、基本原理及应用前景等方面进行了总结,并对其优缺点进行了比较。     

一种不依赖钙离子的酸性α淀粉酶基因的克隆表达

以产酸性淀粉酶菌株Bacillus sp.CN7的基因组DNA为模板,PCR扩增到α淀粉酶成熟肽基因,将该基因插入表达质粒pSE380中,构建重组质粒pSE380-cn7a。将重组质粒导入到Escherichia coli JM109中,IPTG诱导表达。重组酶经Sephacryl S300、Ni-NTA纯化后测定其酶学性质。重组酶CN7A的最适温度为65°C,最适pH为5.5?6.0,对可溶性淀粉的Km值为3.784g/L,最大反应速度为101.2mg/(L·min),该酶的热稳定性不依赖钙离子。     

蛋白质突变库高通量表达筛选方法的研究

人工进化方法被越来越多地应用于重组蛋白的表达筛选及其结构功能的研究,在适当的选择压力下,它可以有效地改善野生型蛋白固有的低表达和低稳定性等问题。本研究就如何进行快速、有效的蛋白质人工进化以提高重组蛋白表达量,进行了方法学探索,通过建立以绿色荧光蛋白为报告基因、结合流式细胞仪分选和96孔板等高通量筛选方法,成功地进行了一例高通量蛋白质点突变库重组表达株的筛选。     

利用TA克隆的方法简便构建入门克隆

Gateway技术是一种通用型克隆方法,其基于λ噬菌体位点特异性重组,将目的DNA快速克隆到各种与Gateway技术兼容的目的载体上,不需要进行酶切和连接反应。但存在获得入门克隆过程中相关反应酶制剂价格昂贵,且药品订购时间较长等问题。通过对入门载体pDONR207的改造,使之产生3’端具有单个T 末端的线性化的入门载体,采用TA克隆的方法替代BP反应,从而简便、经济和快速地获得入门克隆。利用改造后的Gateway技术构建拟南芥SOS2基因的原核表达载体和真核表达载体,通过原核表达和原生质体瞬时表达证明通过此方法构建的表达载体在原核细胞和真核细胞中都得到了很好的表达。     

PCR快速筛选重组克隆方法的建立

目的：建立一种PCR技术快速筛选重组克隆的方法。方法：用Triton裂解菌落作为模板,以pMD-18T载体多克隆位点设计的引物与目的基因猪β-INF引物设计不同组合,PCR扩增待检重组克隆。结果：PCR技术快速筛选出猪β-INF重组克隆并鉴定了插入方向。结论：在采用PCR方法直接使用细菌菌落参与反应可以快速筛选重组克隆。     

提高PCR产物及其克隆效率的几点方法与经验

本文介绍了提高ＰＣＲ产物及其克隆效率的方法与经验：如,引物的设计、目的片段的回收、连接体系、利用引物上所设计的酶切位点克隆、通过平末端克隆,以及加快实验进程的技巧、出现问题如何设计查找原因等。     

金针菇谷氨酸脱氢酶基因的克隆及原核表达

利用简并引物和RT-PCR方法从金针菇(Flammulina velutipes)幼嫩子实体中克隆获得FvGDH全长cDNA序列.构建入门载体pGWC-FvGDH,利用Gateway克隆技术的LR反应构建原核重组表达载体pDESTl7-FvGDH,转化大肠杆菌BL21(DE3).通过IPTG法诱导表达融合蛋白并进行表达条件优化.SDS-PAGE蛋白电泳分析表明,融合蛋白相对分子质量约为53 kD,与预测的一致.最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.4mmol/L、诱导4 h.融合蛋白表达量较高,实现了FvGDH的高效表达,并利用Western blotting对其特异性进行鉴定.FvGDH基因高效原核表达体系的成功建立,为进一步研究FvGDH的酶促动力学奠定了基础.     

不依赖天然外显子的蛋白质内含子定向进化筛选系统

蛋白质剪接技术为在蛋白质水平上直接对蛋白质进行修饰和加工提供了一种全新的解决方案,因而在蛋白质工程及相关领域具有非常广阔的应用前景。现阶段,大部分天然的蛋白质内含子在异源蛋白质中剪接活性非常低,极大限制了蛋白质内含子的开发和应用。为了开发一个可以同时对蛋白质内含子通用性和剪接活性进行筛选的系统,利用Bsa I限制性内切酶识别位点和切割不重合的特性,将Ter ThyX内含子(不含外显子序列)插入到卡那霉素抗性蛋白基因的多个位点。并且摒弃了以往需要结合天然外显子以实现剪接的方法,可以同时对蛋白质内含子的剪接活性和通用性进行筛选。Western blot结果和卡那霉素平板生长结果表明,通过卡那霉素筛选系统可以精确的将蛋白质内含子剪接反应与卡那霉素抗性结合起来,仅从卡那霉素平板上的菌落生长情况即可完成蛋白质内含子剪接活性阳性突变的筛选,是一个快速,稳定的定向进化筛选系统。     

基因功能研究的加速器-高通量克隆表达系统

大规模基因测序已经完成了多个重要物种的基因组序列分析,功能基因组学研究的序幕已经拉开。大规模的体外克隆获得全长或部分的开放阅读框是蛋白质表达、干扰分析和定位分析、相互作用分析的必经环节,对使用简便、成本低廉、保真度高和易于在不同体系中穿梭的高通量克隆体系的了解、评价和使用已经成为基因组水平研究的重要问题。为此,对目前存在的多种高通量克隆体系进行了系统的介绍和比较。     

GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过Gateway克隆技术构建原核重组表达载体pDEST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化.结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h.蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致.重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白.研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

菜籽粕脱毒液中硫代葡萄糖苷提取工艺的研究

本文用两步萃取法从菜籽粕脱毒液中提取硫代葡萄糖苷,以3,5-二硝基水杨酸比色法测定硫代葡萄糖苷含量,采用单因素试验法,分别考察可能影响硫代葡萄糖苷提取效果的各种因素,确定了最佳工艺条件：第一步萃取剂为异辛烷,母液与异辛烷体积比为2：1,搅拌时间为30min,异辛烷萃取次数为2次,异辛烷单次萃取率达71．2％。硫代葡萄糖苷收率为83．7％。     

复合氨基酸铜螯合物的研究

以废弃鸡毛的硫酸水解液作为复合氨基酸的来源 ,将其与CuSO4 ·5H2 O螯合 ,采用有机溶剂沉淀法制取了高纯度的氨基酸铜螯合物 ,并用化学分析和红外光谱分析对其进行了研究 ;同时 ,提出了一种根据直接测定螯合态微量元素的含量来测定螯合率的新方法 ,为螯合率的测定提供了一条新的途径     

氨基酸螯合钙增加骨密度作用的实验研究

为探讨氨基酸螯合钙的增加骨密度作用,实验设低、中、高三个剂量组,另设一个低钙对照组和一个碳酸钙对照组,以200、400、1200mg/kg·bw(相当于人体推荐剂量5、10、30倍)剂量的氨基酸螯合钙给大鼠灌胃13wk,饮用去离子水和摄食低钙饲料,测定大鼠身长、股骨重量、股骨钙含量及骨密度钙表观吸收率等相关指标.结果实...     

制备氨基酸螯合钙的研究进展

综述了国内外主要生产氨基酸螯合钙的制备方法,并提出了一种运用离子交换法制备氨基酸螯合钙的新方法。     

氨基酸锌化合物的研究进展

氨基酸锌作为一种重要的营养添加剂,在补充人体微量元素方面有着重要的作用,本文重点综述了氨基酸锌制备的方法以及制备过程中的影响因素。     

从鸡毛中提取复合氨基酸的研究

运用正交实验研究了以鸡毛为原料硫酸水解生产复合氨基酸的水解条件。结果表明 :硫酸浓度为 8mol·L- 1 ,鸡毛质量 (g)与硫酸体积 (mL)之比为 1∶2 .5 ,水解时间 10h ,其水解率可达 5 5 .2 3%。得到的固体氨基酸质量分数为 95 .31%。     

谷胱甘肽-铬-烟酸螯合物的制备与表征

以烟酸(NA)、谷胱甘肽(GSH)和CrCl3·6H2O为原料,制备高纯度GSH-Cr3+-NA2螯合物,分析影响合成螯合物的主要因素,获得最佳合成工艺,并对获得的螯合物进行表征,确定其螯合比例。结果表明,在Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶4,pH 5.0、温度60℃下反应3h,制备出Cr3+/NA/GSH(mol/mol/mol)=1∶2∶1的GSH-Cr3+-NA2螯合物;红外分析显示,与GSH相比,螯合物的-NH2、-NH-特征吸收峰发生蓝移,-NHC=O中-C=O的特征吸收峰红移,-SH的伸缩振动峰消失,说明GSH上的-NH-、NHC=O中-C=O、-SH均参与相互作用;与NA相比,螯合物的-C=O的伸缩振动峰发生红移,-OH的特征吸收峰消失了,说明NA上的-C=O和-OH参与相互作用。原子力显微镜形貌分析结果指出,由两分子NA和一分子GSH链围绕一Cr3+形成GSH-Cr3+-NA2螯合物。     

二次回归正交旋转组合设计对豆粕氨基酸提取工艺的优化

研究了硫酸水解法提取豆粕中复合氨基酸的工艺条件。在单因素实验的基础上,运用二次回归正交旋转组合设计方法进行了优化,建立回归模型方程并确定最佳工艺条件。结果表明,在液固比25:1、硫酸浓度3.1mol.L-1、提取时间16.0h和提取温度125.0℃的条件下,最佳氨氮得率达59.9mg.g-1。     

N+注入诱变选育菜粕硫苷降解菌的研究

为选育能够高效降解菜粕硫苷( Glucosinolates,Gls)的菌株,利用能降解硫苷的益生菌黑曲霉CICC-2238进行N+注入诱变.经过两次N+注入诱变,在诱变能量为20 keV,剂量为60 ×2.5×1013ions/cm2时,筛选到一株高效降解Gls的菌株H-109.与出发菌相比较,其Gls的降解率由28....     

二次中和法制取菜籽复合氨基酸新工艺研究

为得到高质量的菜籽复合氨基酸,以脱皮菜籽粕为原料,研究了硫酸水解制备复合氨基酸的新工艺一二次中和法,解决了氨基酸脱色和副产品植酸的利用问题。水解的最佳工艺参数是3mol·L-1的H2SO4水解18h;ca(OH)2作中和剂,第一次中和和脱色的最佳pH为2-4,第二次中和的最佳pH为6.5-7.0,中和后的溶液经减压浓缩,喷雾干燥,制得菜籽复合氨基酸。复合氨基酸得率≥40％,纯度≥40％;副产品植酸钙得率10％左右,纯度40％-50％。