链霉菌—大肠菌穿梭质袜载体pSGLgpp的构建及应用

质粒ｐＳＧＬ１（７．４ｋｂ）是从球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｅｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）中分离得到的一个高拷贝质粒,已测定其最小复制子序列。从球孢链霉菌总ＤＮＡ中采用ＰＣＲ方法扩增获得编码Ｃ１０２７前蛋白信号肽的ＤＮＡ片断ｇｐｐ。将ｇｐｐ克隆至ｐＳＧＬ１的衍生质粒ｐＳＧＬＮ中,获得新的链霉菌表达型质粒载体ｐＳＧＬｇｐｐ。应用该质粒进行了人的河溶性白细胞介素１受体Ｉ型的表达。     

链霉菌质粒pSGL1最小复制子序列测定及分析

质粒ｐＳＧＬ１（７．４ｋｂ）是从球孢链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）中分离得到的一个高拷贝质粒,已证明其最小复制子位于Ｓａｕ３ＡＩ酶切的２０ｋｂ片段上。对该片段进行亚克隆,测序后数据表明该片段是一个新序列。仅有一个开放阅读框架（ＯＲＦＲ）位于最小复制子中,推测其编码的蛋白质含有滚环复制质粒复制酶的特定序列。     

苏云金芽胞杆菌质粒pBMB2062的克隆及遗传稳定载体的构建

从苏云金芽胞杆菌ＹＢＴ－１５２０菌株中克隆到１个小质粒ｐＢＭＢ２０６２,序列分析表明该质粒由２ ０６２个核苷酸组成。该质粒含２个编码框（ｏｒｆ１和ｏｒｆ２）,可分别编码由２８９个氨基酸和８０个氨基酸组成的蛋白质。这２个潜在的蛋白质分别与质粒的复制启始蛋白和复制蛋白同源。ｐＢＭＢ２０６２与２个已知同源质粒之间有２３个核苷酸的差异,这些差异引起了ｏｒｆ１编码框的变化。ｃＤＮＡ合成和ＰＣＲ检测显示与ｐＢ     

邻单胞菌邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfd C)的克隆及其在大肠杆菌中表达

根据已报道的邻苯二酚１,２－双加氧酶基因（ｔｆｄ Ｃ）序列,设计ＰＣＲ引物,从一株邻单胞菌（Ｐｌｅｓｉｏｍｉｎａｓ）的ｐＬ１质粒上扩增到ｔｆｄ Ｃ基因片段,连接到ｐＧＥＭ－Ｔ载体上,并转化大肠杆菌ｌＭ１０９菌株,筛选到阳性克隆。序列分析结果表明,ＰＣＲ产物全长８０１ｂｐ,有一阅读框,编码２５５个氨基酸,与增氧产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｌｕｓ）的ｔｆｄ Ｃ基因相比,在６９３位相差一     

幽门螺杆菌的基因分型方法及其应用

近几年,有关幽门螺杆菌（ＨＰ）基因分型方法及其应用的研究取得了很大进展。基因分型方法包括：质粒分型、限制性内切酶分型（ＲＥＡ）、核糖分型、染色体ＤＮＡ脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）分型、多聚酶链反应限制性内切酶消化（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）分型、任意引物ＰＣＲ（ＡＰ－ＰＣＲ）分型、ＰＣＲ单链构型多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分型和核苷酸序列分析等。基因分型方法广泛用于ＨＰ的研究,如基因图的构建、感染复发、耐药机     

转基因人肺腺癌细胞株的建立

以逆转录病毒ｐＬＸＳＬ为载体与人细胞介素２基因（ＩＬ－２）重组,用电穿孔技术将其重组子ｐＬＩＬ—２ＳＮ导入ＰＡ３１７细胞中,建立了逆转染病毒包装体系细胞ＰＡ３１７／ｐＬＩＬ—２ＳＮ。应用逆转录病毒包装体系细胞上清液去转染入肺腺癌细胞ＳＰＣ—Ａ１,经过２０天含Ｇ４１８培液的筛选式培养,历经了５０代的传代培养,获得了转白细胞介素２基因的人肺腺癌细胞株ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２。该细胞（ＳＰＣ－Ａ１／ＩＬ－２）经ＰＣＲ技术验证外源性目的基因（ＩＬ－２ｇｅｎｅ）导入细胞内,且证明该细胞能表达ＩＬ—２基因（有ＩＬ－２的分泌）。我们研究的目的是对肿瘤细胞的特异性抗原修饰、对肿瘤细胞进行处理。试图建立肿瘤疫苗。     

用逆转录病毒载体表达人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子

应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的基因片段和人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）的ｃＤＮＡ,克隆进逆转录病毒载体Ｎ２Ａ,得到重组质粒Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ．经脂质体包装并转染包装细胞,通过Ｇ４１８药物筛选,得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ检测证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ,克隆细胞培养上清用ＴＦ－１细胞可检测到ＧＭ－ＣＳＦ活性。     

Tn10介导的BticryIVA基因在荧光假单胞菌染色体中的整合及表达

苏云金杆菌以色列亚种的杀虫晶体蛋白基因ｃｒｙＩＶＡ被亚克隆到自杀型转座子质粒载体ＰＬＯＦ／Ｋｍ的Ｔｎ１０中,构建了转座子质ｐＬＦ９７Ａ。     

枯草芽孢杆菌bgIS基因在酵母染色体上整合

将枯草杆菌β－１,３－１,４－葡聚糖酶基因（ｂｇＩＳ）２．７ｋｂＥｃｏＲＩ片段和酵母染色体ｒＤＮＡ片段克隆到整合型不含酵母自主复制序列（Ａｕｔｏｎｏｍｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）的大肠杆菌／酵母菌穿梭质粒ＹＩＰ５上,构建成ＹＩＰ５－ｂｇＩＳ－ｒＤＮＡ的杂种质粒ＰＣＺＨ,转化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ并得到表达。稳定性测定表明,Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０１）和Ｙ３３（ＰＣＺＨ１０４）     

用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

PCR扩增葡萄球菌肠毒素A全长基因方法的建立及意义

为了分析和克隆葡萄球菌肠毒素（ＳＥ）Ａ全长基因,设计了一对针对ＳＥＡ全长基因的特异性引物,成功地用ＰＣＲ反应从标准产ＳＥＡ的葡萄球菌基因组中扩增出了一条约７７０ｂｐ的条带,为进一步用ＰＣＲ法克隆ＳＥＡ基因,并把它用于抗肿瘤研究奠定了实验基础     

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的…

通过有机试剂抽提,ＣＦ－１１纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ １到Ｓｅｇｍｅｎｔ １０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）,然后设计合适的引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增,以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ     

用PCR技术克隆细小病毒H－1部分非结构蛋白基因

应用ＰＣＲ技术定向克隆了细小病毒Ｈ－１的非结构蛋白（ＮＳ）部分基因片段。自行设计并合成了ＰＣＲ引物△Ｐ３和△Ｐ４,在两个引物中分别引入两个突变碱基,使扩增后的ＤＮＡ片段的两端含有限制性核酸内切酶ＨｉｎｄⅢ或ＢａｍＨＩ的酶切位点,经双酿切法把该ＤＮＡ片段重组到ｐＵＣ１１８质粒中。对插入片段的ＤＮＡ序列测定和分析结果证实该片段为Ｈ－１ＮＳ－１基因序列。以此重组质粒为探针,采用分子杂交的方法,分别测定了Ｈ－１及ＭＶＭＤＮＡ在细胞内的复制水平。这一基因的克隆为制备Ｈ－１的质量监测、Ｈ－１及ＭＶＭＮＳ－１蛋白抑瘤作用机理及其在肿瘤细胞及正常组织中的转录表达等研究奠定了基础。     

用逆转录病毒载体表达人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子

应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的基因片段和人粒细胞－茂噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＧＳＦ）的ｃＤＮＡ,克隆进逆转录病毒载体Ｎ２Ａ,得到重组质粒Ｎ２ＱＡ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。经脂质体包装并转染包装细胞,通过Ｇ４１８药物筛选,得到抗生克隆。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ检测证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达１０＾４ＣＦＵ／ｍｌ,克     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７,经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆,用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６,得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,经ＰＣＲ检测,ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性,结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成,且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。     

可溶性白细胞介素6受体基因在链霉菌的克隆表达研究

以分离提取的ＨｅＬａ细胞总ＲＮＡ为模板,通过ＲＴ－ＰＣＲ反应扩增得到了１０１７ｂｐ的人可溶性白细胞介素６受体（ｓＩＬ－６Ｒ）ｃＤＮＡ片段,将扩增片段克隆到ｐＵＣ１９质粒中进行序列测定。结果证明该片的序列与文献报道的ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ的序列完全一致,将ｓＩＬ－６ＲｃＤＮＡ与链霉素信号肽ｍｅｌＣｌ的编码序列融合后得到的融合基因ｍｅｌ／ｓＩＬ－６Ｒ克隆到链霉菌质粒ｐＬＪ４５９中,构建成重组表达质粒ｐＬ     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的 …

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自     

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)E蛋白基因真核表达质粒的构建

新近发现的ＰＲＲＳＶ是单股ＲＮＡ病毒,属于不久前成立的动脉炎病毒科。其基因组包括８个开放阅读框架（ＯＲＦ）,其中ＯＲＦ５编码糖基化的囊膜（Ｅ）蛋白,是病毒的主要免疫保护性抗原之一。为了研制ＰＲＲＳ基因疫苗,扩增并克隆了ＰＲＲＳＶ－１ａ株ＯＲＦ５,并将其亚克隆至真核表达载体ｐＣＲ３－Ｕｎｉ的ＣＭＶ启动子下游,构建成真核表达质粒,为ＰＲＲＳ基因免疫奠定基础     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）基因,与ｐＰＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２基因．ＰＡＩ－２基因与表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建受乙醇氧化酶１基因（ＡＯＸ１）启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化ＧＳ１１５宿主菌,经表型筛选和ＰＣＲ扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组ＰＡＩ－２以分泌型表达,占分泌总蛋白的３０％,具ＰＡＩ－２抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗ＳＤＳ复合物,具抑制纤溶的活性（９１．４ＡＩＵ／ｍｌ）．对培养条件也进行了探讨．