绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶基因的克隆及表达特征分析

【目的】克隆绿僵菌第五类Ser/Thr蛋白磷酸酶(PP5)基因,了解该基因及其编码产物的结构特征和两种产孢模式(微循环产孢和正常产孢)中的表达特征。【方法】通过绿僵菌中PP5基因EST序列与全基因组数据库比对,获得PP5基因DNA序列;通过同源蛋白比对预测PP5基因的DNA结构并设计引物,PCR扩增获取PP5全长cDNA序列;通过在线分析工具及生物软件进行蛋白结构分析。采用实时荧光定量PCR检测PP5基因在两种产孢模式中的表达特征。【结果】PP5基因长2100 bp,含7个外显子和6个内含子;cDNA开放阅读框长为1428 bp(GenBank登录号HQ317137),编码475个氨基酸;一级、二级及三级结构分析均显示较保守的蛋白磷酸酶结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,PP5基因在绿僵菌微循环产孢的不同阶段表达水平具有显著性差异,特别是在孢子接种16、24、32 h高表达,而在正常产孢模式下表达量非常少。【结论】克隆了绿僵菌的PP5基因,详细了解了该基因及其编码产物的结构特征,发现了该基因在微循环产孢孢子形成后期高表达的重要特征,为进一步研究该基因在微循环产孢中的功能奠定了基础。     

绿僵菌微循环产孢基因Pyk的克隆及RNA干扰分析

微循环产孢是真菌遭遇逆境时发生的一种产孢机制,具有繁殖快速及抗逆性强等诸多优点。研究绿僵菌的微循环产孢机制并加以利用,对增强该菌在生物防治中的应用效果具有重要的意义。采用绿僵菌基因组数据库与NCBI数据库中同源蛋白比对获得Pyk基因DNA序列;分析Pyk基因结构并设计引物,通过RT-PCR扩增克隆Pyk全长cDNA序列。序列分析显示该基因cDNA全长1 934 bp,开放阅读框长为1 752 bp(GenBank登录号:HQ153828),编码产物为583个氨基酸的丙酮酸激酶,该酶与子囊菌门中其他真菌具有较高的相似性(57%-77%)。构建Pyk基因的RNAi载体,基因枪转化野生型绿僵菌获得3个突变菌株,RT-PCR证实3个干扰突变菌株中Pyk基因的干扰效率分别为:51%、56%、33%。对突变菌株的微循环产孢模式做了进一步分析,结果显示:与野生菌株相比,突变菌株产生更多的孢子形态类型,菌落周边的白色菌丝也相对较少。     

板栗疫病菌cpfluG基因的功能研究

fluG基因在许多丝状真菌中对无性孢子的发育起调控作用,然而在树木病原菌板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)中,无性孢子的发育调控机制尚未完全明确。本研究克隆了板栗疫病菌的fluG同源基因cpfluG,采用同源重组的方法构建了fluG基因缺失菌株ΔcpfluG。相对于野生型菌株,ΔcpfluG突变株几乎完全丧失产孢能力,色素分泌显著减少,但致病性不受影响。cpfluG基因的缺失导致已知的产孢相关基因cls-31表达量显著下调,但不影响pks基因和cls-32的表达。本研究结果揭示,fluG是板栗疫病菌孢子发育调控的一个关键成员,但板栗疫病菌分生孢子发育的调控细节可能有别于已报道的丝状真菌。     

十种虫生真菌液体培养芽生孢子的形态发生

芽生孢子是许多真菌通过出芽方式产生的无性孢子,在液体发酵中主要以这种形式大量繁殖。真菌杀虫剂活性成分分生孢子的大量生产使用液体发酵得到的芽生孢子作为接种物,另外,它也是当今虫生真菌遗传转化的重要受体,因而研究虫生真菌芽生孢子的形态和发生特点具有重要意义。本研究分别对液体发酵中的球孢白僵菌、粉棒束孢、蝉棒束孢、环链棒束孢、玫烟色棒束孢、细脚棒束孢、斜链棒束孢、金龟子绿僵菌、蝗绿僵菌和蜡蚧霉等10种常见虫生真菌芽生孢子的形成过程进行显微观察,了解其分生孢子产生过程的异同。结果表明,芽生孢子的产生方式有两种类型：1）蝉棒束孢在其整个生活史中以菌丝生长为主,芽生孢子产生的数量很少。2）其他各种真菌芽生孢子产生方式相似,在菌丝体形成后就开始大量以菌丝出芽或缢缩产生芽生孢子,接着还可通过芽生孢子的出芽或缢缩断裂产生新的芽生孢子。芽生孢子的产生分为3个时期：初期先由菌丝形成芽生孢子;指数期芽生孢子大量增殖,菌丝和芽生孢子都可产生芽生孢子;后期以芽生孢子产新芽生孢子为主要方式。     

金龟子绿僵菌固态培养生物变量优化研究

金龟子绿僵菌属于真菌类生物杀虫剂,本文研究了接种量、种龄、菌种代数等生物因素对金龟子绿缰菌生长及产孢量的影响,并对液-固两步发酵工艺进行了研究.经过优化,得到金龟子绿僵菌产孢的最佳生物参数是:接种量为2.5g/100g、种龄为5～6天;采用固体二代种,培养6天,孢子产量可达1.531×1010孢子/g干培养基.     

红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

金龟子绿僵菌附着胞分化及其与环腺苷酸cAMP的关联性研究

寄主识别与附着胞分化是虫生真菌启动侵染过程的首要步骤。本文利用先前获得的金龟子绿僵菌基因缺失突变株与其野生型一起进行附着胞分化研究。接种后不同时间下的观察表明,绿僵菌突变株或野生型的附着胞既可以在萌发不久的芽管顶端形成,也可以在伸长菌丝分支的顶端形成。与野生型不同的是,突变株附着胞的分化频率显著下降,附着胞周围也缺乏粘液层的产生。研究表明,绿僵菌的类枯草杆菌类体壁降解酶对于附着胞分化不产生影响,对体壁降解也非完全必需的。与突变株附着胞分化频率显著降低相对应,其胞内环腺苷酸cAMP水平显著下降,而添加外源cAMP能够显著增加其附着胞分化频率,说明绿僵菌cAMP信号途径对于调控附着胞分化起着重要的作用。     

应用荧光染色法检测寄主昆虫体表病原真菌孢子及其附着孢

采用蝗虫翅膀作为侵染组织,探讨了荧光染色剂Calcofluor White M2R在观测寄主体表绿僵菌孢子及其附着孢形成中的应用。结果表明,在荧光显微镜下,清晰可见蝗虫翅膀上发蓝色荧光的绿僵菌孢子、芽管及附着孢,而蝗虫翅膀未被染色,避免了干扰观察目标物。该方法可以准确观察病原真菌孢子在昆虫体表组织的萌发及附着孢形成。     

响应面设计优化莱氏绿僵菌SZCY固体发酵培养条件及致病力测定

【背景】莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)对新入侵我国的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)具有较强的致病力和田间流行性,因此具备深入开发的价值。【目的】优化莱氏绿僵菌SZCY固态发酵培养条件,测定所产分生孢子对草地贪夜蛾幼虫的毒力,为提高该菌株分生孢子规模化生产奠定基础。【方法】采用单因素试验确定了相对适宜的固态培养基,利用Box-Behnken响应面法优化该菌株的固态培养基和发酵参数,同时评价不同条件下该菌所产分生孢子对草地贪夜蛾幼虫的毒力。【结果】去颖稻谷(rice)为莱氏绿僵菌SZCY菌株固相产孢最佳载体。培养温度、光周期及酵母浸粉含量是影响莱氏绿僵菌SZCY固态发酵产孢量的主要因素。莱氏绿僵菌SZCY固态发酵最佳工艺参数为温度22.83℃、光周期18.68 h L:5.32 h D、酵母浸粉4.98 g/100 g,在此条件下,莱氏绿僵菌在去颖稻谷固态培养基上的产孢量为5.65×10¹⁰孢子/g,用其制备浓度为10⁷孢子/mL的孢子悬浮液,对草地贪夜蛾3龄幼虫的LT₅₀为3....     

真菌G蛋白信号调控蛋白的功能研究进展

G蛋白信号途径是真菌细胞信号转导网络的枢纽,在细胞的各种生物学调控过程中具有重要作用。G蛋白信号调控蛋白(Rgulators of G protein signaling,RGS)是一类重要的G蛋白信号调控因子,能通过促进G蛋白α亚基(Gα)偶联的GTP水解,使Gα和Gβγ亚基发生聚合,导致G蛋白失活,从而迅速关闭与G蛋白偶联的信号途径。自从第一个RGS蛋白在酿酒酵母中被鉴定以来,目前已经有30多个RGS蛋白在重要的模式真菌中被报道,包括构巢曲霉、绿僵菌、稻瘟病菌、玉米赤霉菌、轮枝镰孢菌、新型隐球菌和白色念珠菌等。RGS蛋白在真菌的营养菌丝生长、产孢、毒素和色素生产、致病性和有性生殖等过程中发挥着重要作用。本文对真菌中已报道RGS蛋白的功能进行了总结,对真菌RGS蛋白的结构特征和调控机制进行了评述。