葡萄酒苹果酸-乳酸菌精氨酸代谢研究概况

葡萄酒苹果酸-乳酸菌的精氨酸代谢会导致葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的增加,从而严重影响葡萄酒的饮用安全性。近年来研究表明,葡萄酒苹果酸-乳酸菌的精氨酸代谢途径是精氨酸脱亚氨基酶途径(Arginine deiminasepathway,简称ADI途径)。系统分析苹果酸-乳酸菌的ADI途径、精氨酸转运机制、ADI途径酶的调节等方面的研究进展,阐明葡萄酒苹果酸-乳酸菌的精氨酸代谢对酿造优质葡萄酒具有重要的理论和实际意义。     

酱醪嗜盐四联球菌的分类及特性研究

【目的】对酱油酱醪来源的嗜盐四联球菌进行分类,并比较菌株的生理特性。【方法】采用多位点序列分型和糖类代谢聚类分析相结合的方法对菌株进行分类,通过菌株对环境耐受性分析研究菌株的生理特性。【结果】酱醪来源的12株嗜盐四联球菌被分为两个类群,菌株所属类别与其分离的原生环境存在一定的关联性。嗜盐四联球菌C25、C33、C3、R55耐高盐及高糖能力均较强,菌株C1、R44和R23耐高盐能力较强。虽然嗜盐四联球菌普遍不耐酸,但是菌株C33和R44在酸性培养体系(pH 5.0)中仍能正常生长。较低的培养温度(15℃和25℃)对嗜盐四联球菌的生长有显著抑制。【结论】采用基因型与表型结合的方式成功将酱醪来源的嗜盐四联球菌归为2个类群,不同类群的菌株在耐高渗等生理特性上具有差异性。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

中度嗜盐菌四氢嘧啶合成基因的克隆与功能分析

中度嗜盐菌Bacillus alcalophilus DTY1分离自晋西北黄土高原盐碱土壤, 能够产生耐盐相关的相容性溶质四氢嘧啶。为了研究四氢嘧啶的功能, 克隆了DTY1菌株四氢嘧啶合成基因簇ectABC。ectA、ectB和ectC分别编码169、428和132个氨基酸的肽链, 分别与B. halodurans C-125中的二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC)同源性达59%、81%和81%。将携带该基因簇的4.0 kb片段转入蜡质芽孢杆菌B. cereus Z后, 芽孢杆菌的耐盐度显著提高。HPLC检测发现, 在1.0% NaCl浓度下, 转化菌B. cereus Z-E菌株生成70.1 mg/g四氢嘧啶, 而在5.0%的NaCl浓度下四氢嘧啶的产量高达118.6 mg/g, 显著高于B. alcalophilus DTY1的四氢嘧啶产量。而且随着盐浓度的提高, 四氢嘧啶的合成量也随之提高。由此证明四氢嘧啶参与中度嗜盐菌重要的渗透调节, ectABC的表达受盐诱导。     

蜡样芽胞杆菌在双歧杆菌四联活菌片治疗小鼠腹泻中的作用研究

目的研究双歧杆菌四联活菌片中的蜡样芽胞杆菌对小鼠腹泻治疗作用的影响。方法将SPF小鼠采用抗生素联合伤寒沙门菌和志贺菌诱导建立腹泻模型,取112只造模成功后的小鼠随机分为7组,其中三组分别喂养3种不同剂量的四联活菌片,三组分别喂养3种不同剂量的不含蜡样芽胞杆菌的三联活菌片,余下一组为对照组灌胃生理盐水。比较各组小鼠腹泻的治愈时间,测定粪便菌群、结肠组织耗氧能力及氧化还原电势、肠内sIgA含量及脾脏指数变化。结果相同剂量条件下,含蜡样芽胞杆菌的四联活菌片治愈腹泻时间比三联活菌片缩短48~72h。治疗48h后,四联活菌片组肠内sIgA水平明显增加,与三联活菌片组相比差异有统计学意义(t=5.5783,P=0.0002);治疗结束后,四联活菌片组的脾脏指数也显著高于三联活菌片组(t=18.8648,P=0.0001)。结论含蜡样芽胞杆菌的四联活菌片对小鼠腹泻的治疗及肠道菌群的恢复作用比三联活菌片效果更佳,能显著促进腹泻小鼠肠黏膜局部免疫力的提高。     

酒醅中精氨酸利用菌株的分离筛选及其对浓香型白酒中瓜氨酸积累的影响

【目的】分析浓香型白酒酒醅发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质瓜氨酸含量显著增加的原因,确定酒醅中能够利用精氨酸并积累瓜氨酸的微生物,为解析白酒中氨基甲酸乙酯的形成机制提供研究基础和理论依据。【方法】采用高通量筛选技术,从浓香型白酒酒醅中分离具有高精氨酸利用能力和高瓜氨酸积累特性的菌株,并通过基因型和表现型验证以及模拟窖内发酵验证它们对瓜氨酸积累的贡献。【结果】共筛选获得20株具有高精氨酸利用能力的菌株,其中Lactococcus garvieae LD3,Bacillus amyloliquefaciens BG5,Pediococcus acidilactici PH7和Staphylococcus pasteuri SH11具有较高的瓜氨酸生成能力,并可使酒醅中瓜氨酸含量显著增加。【结论】筛选获得的4类微生物均能够通过ADI途径代谢积累瓜氨酸,是导致酒醅瓜氨酸含量增加的原因。     

基于PTP转运蛋白的瓜氨酸利用菌株高通量筛选策略及其应用评估

【目的】为降低发酵体系中氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的浓度,建立基于PTP (putative transport protein)转运蛋白的瓜氨酸利用菌株高通量筛选策略,对不同样品中的瓜氨酸利用菌株进行分离、筛选和鉴定,并对其胞外瓜氨酸利用能力进行比较和分析。【方法】通过对瓜氨酸转运蛋白PTP的氨基酸序列进行比对分析,确定其保守区域,并通过设计获得简并引物,结合溴甲酚紫变色圈法、简并引物菌落PCR和二乙酰一肟显色法,建立瓜氨酸利用菌株的高通量筛选策略。【结果】设计出一对可用于筛选瓜氨酸利用菌株的简并引物,利用建立的高通量筛选策略从环境中分离获得65株具有瓜氨酸利用能力的菌株,其中Levilactobacillus brevis PC4可在4 h内消耗体系中91.08%的瓜氨酸。对分离菌株PTP编码基因在基因组中的位置进行分析发现,Latilactobacillussakei等4株菌的PTP编码基因都位于arc基因簇内,表明PTP蛋白的功能与分离菌株的瓜氨酸代谢途径密切相关。【结论】PTP蛋白是菌株胞外瓜氨酸利用的重要功能蛋白,基于PTP编码基因设计的高通量筛选策略可用于高效地从环境中分离...     

解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用

【目的】通过诱变育种提高解淀粉芽孢杆菌JY06利用精氨酸的能力,并将其用于降低酱油中的氨基甲酸乙酯及前体,从而提高酿造酱油的安全性。【方法】采用等离子诱变和紫外诱变两种诱变育种方法对解淀粉芽孢杆菌JY06进行突变,应用高通量筛选手段获得具有高精氨酸利用能力的突变株,验证突变株降低酱油中氨基甲酸乙酯的能力。【结果】获得了12株精氨酸利用能力提高的突变株,与出发菌株JY06相比,突变株C12和E6可使酱油中瓜氨酸含量分别降低了15.6%和14.7%,EC的含量分别降低了19.3%和13.1%。【结论】通过等离子诱变和紫外诱变进一步提高了解淀粉芽孢杆菌JY06降低酱油中EC及其前体瓜氨酸的能力,具有控制或减少酱油中生物危害物的应用潜力。     

Impact of winemaking practices on arginine and citrulline metabolism during and after malolactic fermentation

AIMS: To study arginine degradation and carcinogenic ethyl carbamate precursor citrulline formation during and after malolactic fermentation (MLF). METHODS AND RESULTS: MLF was induced in white wine with two commercial Oenococcus oeni strains under different winemaking conditions regarding the type of alcoholic fermentation (spontaneous, induced) and the lees management (racked, on lees). Arginine degradation and citrulline formation did not occur during malic acid degradation in any treatment. In five of the six treatments in which arginine degradation took place, it occurred 3 weeks after malic acid depletion and significant amounts of citrulline were formed. Presence of yeast lees in wines led to increased citrulline formation. Conclusions: This study suggests that arginine metabolism is inhibited in oenococci at low pH values (< 3.5) and that in the postalcoholic fermentation phase, citrulline formation from arginine degradation can be avoided if MLF is induced by pure cultures of O. oeni with inhibition of the bacterial biomass after malic acid depletion. Residual yeast lees in the wine have been identified as a significant risk factor for increased citrulline formation. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: Conclusions drawn from this study allow reducing the risk of carcinogenic ethyl carbamate formation from citrulline excretion by wine lactic acid bacteria.     

苏云金芽胞杆菌rocE基因的转录调控

【目的】rocE基因编码精氨酸降解途径中的精氨酸通透酶,通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt) rocE基因的转录活性,明确rocE基因的转录调控机制。【方法】通过RT-PCR确定rocE基因所在基因簇的转录单元;β-半乳糖苷酶活性测定分析rocE基因启动子(ProcE)的转录活性;采用同源重组技术敲除BtHD73菌株的rocE基因;通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化RocR蛋白的HTH结构域;通过凝胶阻滞实验明确RocR与rocE基因启动子的结合作用。【结果】在M9培养基中,精氨酸可诱导ProcE的转录活性;在SSM培养基和精氨酸诱导培养基中,与出发菌株HD73相比,ProcE在sigL (编码Sigma54因子)突变体和rocR突变体中的转录活性显著下降。RocR-HTH蛋白与ProcE有结合作用。rocE基因的缺失对菌体生长和Cry1Ac蛋白产量无显著影响。rocE缺失突变体的芽胞形成率为65.5%,HD73出发菌株为85.7%,显著性分析结果表明差异显著(P0.05)。【结论】rocE基因的转录活性受Sigma54的控制,并受RocR正调控。rocE基因的缺失影响菌株的芽胞形成率。     

鲁氏接合酵母对酱油中氨基甲酸乙酯前体物的代谢

【目的】研究鲁氏接合酵母氮源代谢特性,确定鲁氏接合酵母氮源代谢与酱油中氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸和尿素积累的关系。【方法】通过单一氮源培养、偏好型氮源培养和盐胁迫培养,检测不同条件下鲁氏接合酵母对精氨酸、瓜氨酸和尿素的代谢能力。【结果】通过对鲁氏接合酵母氨基酸利用能力的分析,确定了甘氨酸、丙氨酸和天冬酰胺3种氨基酸为鲁氏接合酵母的偏好型氮源。在偏好型氮源存在时,鲁氏接合酵母对尿素和瓜氨酸的利用并不受到抑制,丙氨酸和甘氨酸还能够促进对二者的利用。鲁氏接合酵母在单一氮源培养条件下不会降解精氨酸而积累尿素和瓜氨酸,反而可以大量利用氨基甲酸乙酯的前体物尿素和瓜氨酸。但在盐胁迫下,鲁氏接合酵母利用尿素和瓜氨酸受到阻遏,从而造成酱油中氨基甲酸乙酯前体物不能被充分利用而积累。【结论】盐胁迫阻遏了鲁氏接合酵母对瓜氨酸和尿素的利用,从而造成酱油发酵过程中耐盐细菌所产生的氨基甲酸乙酯前体物的积累。     

敲除aceE基因对猪链球菌丙酮酸代谢的影响

【目的】探究缺失编码丙酮酸脱氢酶蛋白的aceE基因对猪链球菌生长特性、三羧酸循环和丙酮酸代谢的影响。【方法】通过测量菌液的OD600值,绘制野生型菌株与aceE基因缺失突变株的生长曲线;利用试剂盒测定三羧酸循环和丙酮酸代谢旁路中乙酰CoA、琥珀酸CoA、延胡索酸、草酰乙酸、丙酮酸、乳酸和ATP的含量,通过荧光定量qRT-PCR确定柠檬酸合酶基因、苹果酸脱氢酶基因、琥珀酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、丙酮酸脱羧酶基因、乳酸脱氢酶基因、乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因的表达水平。【结果】与野生株相比,菌株ΔaceE在平台期OD600值下降;添加1g/L乙酸盐能够显著提升菌株ΔaceE平台期OD600值。菌株ΔaceE的丙酮酸含量上升,ATP含量下降;三羧酸循环代谢中乙酰CoA、琥珀酸CoA、延胡索酸含量降低;柠檬酸合酶基因和苹果酸脱氢酶基因表达水平上升,琥珀酸脱氢酶基因和异柠檬酸脱氢酶基因表达水平下调;在丙酮酸代谢旁路中丙酮酸脱羧酶基因、乳酸脱氢酶基因、乙醇脱氢酶基因和乙醛脱氢酶基因表达水平上升。【结论】结果显示,菌株ΔaceE三羧酸循环活性降低,虽然能够通过PDH旁路将部分丙酮酸分解为乙...