利用不相容质粒共转化大肠杆菌对Cre重组酶体内重组活性的可视检测

源自噬菌体P1的Cre重组酶可以识别 34bp的靶DNA序列loxP ,进行位点特异性的重组反应。为了简便地检测Cre酶在大肠杆菌中的重组活性 ,分别将cre基因和上下游带有loxP的绿色荧光蛋白基因 (gfp)克隆到具有不同抗性的两种不相容质粒中 ,然后将构建的原核表达载体pET30a Cre和pET2 3b loxGFP电击共转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,利用卡那霉素和氨苄青霉素双抗生素抗性进行筛选。通过直接观察转化子的绿色荧光 ,便可以显示Cre酶的体内重组活性 ,并进一步通过SDS PAGE分析、质粒酶切鉴定进行了验证。结果表明 :以gfp为报告基因、通过两种不相容质粒共转化大肠杆菌可以为研究和改进Cre loxP重组系统提供一种简便直观的检测方法     

氨基移换作用研究的新进展

酶促氨基移換作用是苏联生物化学家和在1937年发現的。他們用鴿胸肌与L-谷氨酸及丙酮酸在无氧条件下共同保温时,发現谷氨酸的氨基不經脫氨直接轉給丙酮酸,生成丙氨酸与α-酮戊二酸;而且这一反应是可逆的。他們給这一新型的反应命名为氨基移换反应,催化这一反应的酶,命名力氨基移换酶。     

生物催化甲醛生成L-木糖

在当今不可再生资源日益消耗的情形下,利用生物合成的技术,将甲醛转变成糖类,具有重要意义。该过程最重要的是找到一个合适的催化剂组合来实现甲醛的二聚反应。在最近的研究中,报道发现了一种乙醇醛合酶(Glycolaldehyde synthase,GALS)可以催化这一反应,将其与D-果糖-6磷酸醛缩酶(D-fructose-6-phosphate aldolase,FSA)组合使用,即"一锅酶"法,可以利用甲醛合成L-木糖,并且转化率可达64%。这一过程的实现也为合成其他糖的反应提供了参考。     

合成生物催化中关键科学问题的研究进展

合成生物催化以多酶催化为特征,通过灵活选择不同功能的酶和反应路线设计,可以实现复杂生物基化学品的合成,在反应效率、原子经济性和环境友好方面有着不可替代性。但是其还存在两个关键科学问题:(1)氧化还原酶催化过程中辅酶的循环再生和重复利用;(2)酶在非水相和油水两相反应体系中如何实现稳定。以CO_2合成生物甲醇和天然油脂制备生物聚氨酯材料这两个具有代表性的多酶催化过程为例,介绍了合成生物催化关键科学问题的研究进展。其中,新型纳米材料与生物技术相结合在解决催化体系中辅酶再生、多酶协同以及酶的界面稳定方面有着广阔的发展前景。     

多酶共固定化的研究进展

固定化酶技术是现代生物催化的核心技术。过去几十年里,固定化酶技术的研究主要集中在单酶固定化。近年来,多酶共固定化由于具有可增加反应的局部浓度、提高反应收率等优点而得到研究者的广泛关注。本文根据国内外研究现状并结合本实验研究从多酶非特异性共价共固定化、非特异性非共价共固定化、非共价包埋固定化以及位点特异性固定化四个方面阐述多酶固定化方法的研究进展,并分析和展望了其在工业上的应用前景。     

生物转化中的逆胶囊酶催化

作为生物催化剂的酶以其催化力强、范围广、专一性高,适合于温和条件、水溶液和低底物浓度中催化等特点而得到广泛应用。酶固定化技术的发展使酶催化的工业应用范围更为广阔,但酶促反应需要以水为反应介质,若反应物难溶于水或反应本身要求不能有大量水存在(如酯化反应),则传统的酶反应就难于实现。这些因素限制了酶在工业上的应用。     

酶和底物分子之间相互作用力对扩散控制反应速率的影响

本文是探讨在溶液中酶和底物分子之间相互作用力对扩散控制反应速率的影响,特别考虑到酶分子具有活性中心这一空间结构,及由它产生的力场作用,处理非球形对称扩散过程。从此可看到作用力是如何控制着底物分子的扩散及其在酶分子活性中心上定向作用,各种分子力对反应速率的影响,并且解释了一些实验结果。此外,给出了在溶液中酶-底物分子反应体系的力场等高线和浓度等高图。     

关于多功能酶与多酶复合体的教学

多功能酶与多酶复合体这两个概念有的学生在学习生化时不易分清。究其原因 ,盖由于多酶复合体所含多种酶其分别表现出的酶功能加在一起也有多种所致。实际上这两个概念不仅定义不同 ,而且有其特点可循。多功能酶是指在不同条件下显示不同催化功能的同一种 (酶 )蛋白 ,具体表现在酶所作用的底物和催化的反应在不同条件下是不同的 ,但其氨基酸顺序是不变的。最简单的多功能酶即双功能酶 ,如磷酸果糖激酶 2与果糖二磷酸酶 2 ,分别催化下列两个不同的反应 ,但其氨基酸顺序是一样的 ,只是其中一个较为特殊的Ｓｅｒ—ＯＨ发生磷酸化与否的差别 (该…     

催化混杂性驱动的酶功能重塑

作为生物催化剂,酶蛋白介导的生化反应具有条件温和、绿色环保等优点。然而相比化学催化剂,天然酶功能的局限性制约了它在生物制造领域的广泛应用。前期研究表明,酶蛋白除了催化专一性外,同时还展现出混杂性的一面,可在特定条件下催化非天然模式反应。这一特性为酶分子功能重塑提供了新思路,可用来指导人工酶设计,拓展天然酶的催化边界,实现新颖酶促反应类型,以扩大酶催化应用场景。本文从酶催化功能混杂性背后可能的进化机制入手,综述了当前诱导酶催化功能混杂性的常用策略,如定向进化、构象动力学、反应条件诱导及祖先酶重构等技术,并从催化机制、构效关系及适应性进化等多个角度,结合近年来相关研究实例,探讨了催化功能混杂性背后的分子机制,为突破天然酶促反应局限性、创制催化非天然反应的高效人工酶元件提供参考。     

PAR对氨基酰化酶不可逆抑制动力学研究

本文将邹氏的在酶的活性修饰剂存在下的底物反应动力学理论应用于氨基酰化酶被金属螯合剂PAR脱锌而失活的动力学研究。通过对不同浓度的PAR存在下底物反应过程和含有PAR的不同浓度的底物中酶促反应的分析,讨论了PAR对氨基酰化酶的脱锌机制。这一过程很可能按如下机制进行:首先,PAR与酶分子活性部位的锌结合,形成一复合物,这一步是较快的反应,然后发生一个可逆的构象变化,最后是不可逆的去锌步骤。锌的存在显然稳定了酶活性部位的构象,而这正是酶活性所必需的。     

探讨酶的记忆

酶是否具有对其反应底物形成记忆是一个值得探讨的问题。在底物与酶相互作用中,底物诱导酶产生与其互补结合的构象,其构象的稳定性,决定了酶对底物的高度选择性。尽管某种酶能够与多个底物Sn(n=1,2,3…)发生反应,但如果酶先与S1反应,则酶将降低对S2、S3等底物的选择性,反之亦然。这似乎是酶(蛋白质)与底物S1作用后,对S1形成了记忆。     

酶促反应中的化学平衡改变

一般教科书中认为酶促反应不能改变其本身化学平衡的方向和限度。但酶学研究表明:酶促反应中的化学平衡可以从热力学或动力学角度发生改变,相关酶促反应的内部化学平衡理论和天然产物酶促选择性合成实例业已广泛报道,在教学与科研中应予重视,这对深入认识酶催化的本质、指导药物化学等研究具有重要意义。     

微囊载体固定化多酶的研究进展

多酶催化是利用多种生物酶构建反应体系或网络,在生物体外实现化学品的合成。在生物制造过程中,多酶的共固定化有利于提高酶的稳定性和重复使用率,更利于多酶间的协同催化。在精准调控下,多酶固定化载体的微囊材料有望实现多酶协同催化性能的最大化。本文中,笔者分析了微囊体系的特点,综述了微囊材料及其固定化多酶的优缺点,总结了微囊多酶固定化体系的应用案例,探讨了其未来发展和应用前景,以期为后续的研究提供参考和指导。     

也谈多功能酶与多酶复合体

“关于多功能酶与多酶复合体的教学”《生物学杂志》 ,1 7( 5 ) :4 4一文提出了生化教学中两个易混淆的概念。笔者认为 ,提出教学难点 ,进行充分的讨论 ,有助于明辨是非 ,澄清认识 ,提高教学质量。上文在阐述这两个概念时 ,强调了多酶复合体中每种酶催化的反应彼此之间有反应链的特征 ,而多功能酶中每种酶催化的反应之间并无反应链的关系。这种立论是片面的 ,是不符合迄今所知的许多实验事实的。例如 ,催化脂肪酸生物合成的脂肪酸合成酶 ,在大肠杆菌中以多酶复合体的形式存在 ,它是以酰基载体蛋白 (ＡＣＰ)为核心 ,6种酶排列在四周而构成的…     

透明颤菌血红蛋白对两种D-氨基酸氧化酶的不同影响及机理研究

D-氨基酸氧化酶是两步酶法制备7-氨基头孢烷酸(7-ACA)这一半合成头孢类抗生素的主要前体的关键酶.它催化的反应是需氧反应,反应体系的溶氧水平是酶活的限制因素之一.我们发现将纯化的透明颤菌血红蛋白(VHb)分别添加到三角酵母来源(TvDAO)和红酵母来源(RgDAO)的D-氨基酸氧化酶的纯酶中,可提高这两种氧化酶的活力35%和48%.细菌双杂交实验证明,透明颤菌血红蛋白与RgDAO有相互作用,而与TvDAO没有关联.这说明透明颤菌血红蛋白对氧化酶活力的促进是由于自身向氧化酶提供游离氧,而且它与氧化酶之间的相互作用可以增强这种效果.我们可以利用透明颤菌血红蛋白的这种性质把它作为氧化酶酶促反应的添加剂,提高酶促反应的效率,如果该氧化酶与之有相互作用,效果会更加显著.     

兔肾皮质-D氨基酸氧化酶和α-羟酸氧化酶的铈法定位及能谱分析

用铈作捕捉剂,在光镜和电镜下进行兔肾皮质的D-氨基酸氧化酶和α-羟酸氧化酶活性定位。光镜下用Ce-DAB法可显示这两种氧化酶的定位;电镜下,这两种酶主要定位在肾近端小管微绒毛和过氧物酶体上,用能谱仪对这些酶反应产物进行X射线微区元素分析显示铈峰,表明酶的铈法反应具特异性。     

重组黄杆菌肝素酶III的纯化、表征及培养条件对酶生产的影响

肝素酶III是一种特异性地裂解乙酰肝素的酶,在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。为实现肝素酶III的可溶性表达,利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与肝素酶III融合性能,通过构建相应的表达质粒pGEX-heparinaseIII,在大肠杆菌中实现了肝素酶Ⅲ的可溶性表达。粗酶通过一步亲和纯化其纯度可达95%以上。通过对LB培养基摇瓶培养Escherichia coli BL21的诱导时机、诱导剂用量、诱导时间等培养条件的优化,确定了该可溶性肝素酶III融合蛋白的最适生产条件。通过对纯酶的最适反应温度、pH、Ca2+浓度等一系列性质研究,确定了该酶的最适反应条件。     

关于酶促反应速度与酶反应的初速度的教学

酶促反应速度是酶促反应动力学中的一个基本概念。一定条件下 ,酶催化反应的活力大小要由该反应条件下酶促反应速度来反映和确定 :酶促反应速度越小 ,酶活力越小 ;反之 ,酶促反应速度越大 ,酶活力也越大。在研究底物浓度、酶浓度、温度、ｐＨ、激活剂、抑制剂等因素对酶活力的影响时 ,都必须测定酶促反应的速度。为了排除实验中存在的一些干扰 ,一个酶的酶促反应的速度要在酶促反应进行的初期测定 ,即测定所谓的酶促反应的初速度。在教学过程中 ,学生不易弄清楚酶促反应速度与酶促反应的初速度之间的关系。我们发现 :当一般地问起酶反应速度…     

关于酶促反应速度与酶促反应的初速度的教学

酶促反应速度是酶促反应动力学中的一个基本概念。一定条件下，酶催化反应的活力大小要由该反应条件下酶促反应速度来反映和确定：酶促反应速度越小，酶活力越小；反之，酶促反应速度越大，酶活力也越大。在研究底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂等因素对酶活力的影响时，都必须测定酶促反应的速度。为了排除实验中存在的一些干扰，一个酶的酶促反应的速度要在酶促反应进行的初期测定，即测定所谓的酶促反应的初速度。在教学过程中，学生不易弄清楚酶促反应速度与酶促反应的初速度之间的关系。我们发现：当一般地问起酶反应速度在何时测定时，绝大多数学生都会回答在酶促反应的初期；而当问起酶促反应动力学中的v-[S]曲线(图1)上的酶促反应初速度在哪里和为什么时，却有相当一些学生指出在曲线的原点处做切线，切线的斜率就是；有的则指出是与1/2vmax相应的位置的速度值；个别的则指出是与vmax相应的位置的速度值。只有极少数学生指出曲线上的每一点相应的速度值都是酶促反应初速度所在。实际上，正确的答案应为曲线上的每一点相应的速度值均为该底物浓度[S]处的酶促反应初速度值。     

元宝枫叶蛋白酶的动力学特征

酶促动力学是研究酶促反应的速度及各种因素如底物浓度、酶浓度、抑制剂、激活剂、温度、pH等对酶促反应速度影响的科学,是酶学研究中重要的内容。在一定条件下,酶促反应都有其特定的动力学参数,如Km值（米氏常数）和Vmax值（最大反应速率）等。Km是反映酶动力学性质的重要特征性常数,对某一酶促反应而言,在一定条件下都有特定的Km值,可以用来鉴别酶。Km值还可以判断酶的专一性和天然底物,