转基因猪体内外源基因的整合鉴定

外源猪生长激素基因被导入湖北白猪．为避免羊、猪之间在金属硫蛋白启动上的同源性而造成PCR检测结果的假阳性,分别将PCR合成反应的两个引物设计在羊金属硫蛋白基因启动子一侧和猪生长激素一侧,使PCR合成反应的结果特异地反映外源基因的整合性,准确地鉴定出转基因猪．DNA印迹分析结果表明,43头待检仔猪中有6头呈外源基因整合阳性．     

榕江香猪生长激素基因的鉴定及功能分析

生长激素是调节动物生长的主要激素.本研究应用聚合酶链式反应技术从榕江香猪的基因组文库中分离出1.903kb生长激素基因.克隆的生长激素基因由五个外显子和四个内含子组成.榕江香猪生长激素基因的碱基序列与已知四个国外猪种和9个中国地方猪种之间的同源性为97%～99%,其间的差异主要集中在内含子2和4.通过限制性内切酶（DdeI,NarI,BsmNI）分析,鉴定出榕江香猪生长激素基因的五个多态性位点,分别位于5＇-侧翼区274（T/C）位点,外显子2的622（G/A）和631（G/A）位点,内含子2中的841（T/C）以及外显子4中的1 358（A/G）位点.同时,1 358（A/G）位的碱基改变导致榕江香猪生长激素成熟肽第108位异亮氨酸替换,三维结构分析表明,异亮氨酸的存在可能导致生长激素与受体间亲合力降低.     

重组猪生长激素表达研究进展

猪生长激素作为猪生长发育过程中起主导作用的蛋白质激素,能增加肌肉组织蛋白含量、降低脂肪含量、促进骨骼发育、刺激乳汁分泌等,是畜牧养殖业中值得开发利用的激素之一。利用基因工程技术生产重组猪生长激素使猪生长激素在生产上应用成为可能。本文简要介绍了猪生长激素,总结了重组猪生长激素表达的研究进展,并展望了重组猪生长激素的应用与发展前景。     

克隆的水貂生长激素

日本基因公司宣布已克隆了水貂的生长激素(mGH).已经有关于牛和猪生长激素和鱼类生长激素的克隆和实用化研究,都瞄准提高食用家畜和牛乳的生产性和品质改良.用     

科技文摘

美国华盛顿等大学的科学家已将产生生长激素的人类基因移植到兔子、绵羊和猪体内。在兔子和猪体内这些基因已成功地行使它们的生理功能,制造出了人类生长激素。多数动物都不能接受外来基因,不能把外来基因接合到自己的染色体上。然而,在华盛顿大学科学家进行的试验中,猪和兔子后代的11—13％接受了外来基因,这些外来基因能否正常地遗传下去目前尚不清楚。     

猪生长激素研究进展

猪生长激素是由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素。本文就猪生长激素基因的结构特点,多肽性研究、基因表达及猪生长激素的结构特点、生理功能、分泌规律及与其抗体的相互作用等方面进行了综述。     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用.本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪.将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植.先后移植了1889枚1~4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎).体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响.当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率(100%),而排卵后移植妊娠足月率为0%.对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%.RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因.以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFa...     

猪生长激素cDNA的全序列分析

本文报道了两个猪生长激素cDNA的全序列分析的结果。猪生长激素cDNA是我们由猪垂体mRNA经过反向转录、克隆和筛选后获得的。文中还将这两个序列与Seeburg等(1983)报道的序列以及Vize等(1987)报道的猪基因组生长激素基因的序列进行了比较和讨论。     

猪和羊生长激素基因有一定程度的差异

湖北省农科院生物技术研究所郑新民等对猪羊生长激素基因的保守性作了研究。他们发现猪羊不同家畜间的生长激素基因有差异。在研究中 ,通两对引物P1∶ 5′ agctggattcttacggctgagcc 3′ ;P2∶ 5′ tccg gaagcaggagagcagaccgtag 3′ ;P3∶5′ gctgacacctacaaggagtttg 3′ ;P4∶5     

转基因猪染色体原位杂交外源生长激素基因定位

近些年来随着原位杂交技术的不断改进,该技术已广泛用于染色体的基因定位。非放射性标记探针的应用使基因定位变得更加简单易行,从而有可能对动物的转基因进行定位研究。本文首次采用胶体金标记药盒（Anti-digoxigenin-gold)和银加强试剂（Silver enhance-ment reagents)的非同位素原位杂交技术对转基因猪外基因进行了定位研究。如Fig.1所示：表达质粒pSMTPGH含有载体pUC19,羊启动子MT011和猪生长激素PGH基因。选5头带有pSMTPGH的转基因猪,分别制备含有染色体DNA的杂交膜。用BglII和Smai对pSMTPGH进行完全酶切,收集0．9kb片段作为探针,以dig-11-dUTP进行标记。探针与DNA杂交后,用光学显微镜检查。选择分散良好、显影银颗粒清楚的玻片进行摄影记录（Fig.2)。对染色体上的显影银颗粒进行统计分析,参照家猪的染色体标准带型,确定外源PGH基因整合位点。Fig.3为4104号转基因猪染色体上的银颗粒分布情况。对5头转基因猪外源PGH基因定位的结果见Table1。探针的合理设计是外源基因定位研究成功的关键。本实验所用探针必须地与外源PGH基因杂交,而不受内源PGH基因的影响。我们设计的探针符合这一要求。采用dig11－dUTP标记探针,抗体金显色,银加强试剂放大杂交信号,在光学显微镜下可以直接观察杂交位点处的显影银颗粒,但于对实验进行统计分析。估计数据表明：转基因猪的外源PGH基因随机整合在所有染色体上,但在13号染色体上的机率略高。     

转Fat-1基因猪的制备和整合检测

为了在转基因猪肌肉中高效率表达Fat-1基因,且进一步得到富含ω-3 PUFAs猪品系建立技术基础。将化学合成的人源化Fat-1基因克隆到表达载体上,构建能够在猪细胞中高效表达的质粒构件p MSTN-ω3,使用胚胎原核显微注射方法制备转h Fat-1基因猪。试验对16头供体母猪超数排卵,人工授精配种后手术法冲取320枚1~2细胞期猪胚胎。原核显微注射法向胚胎导入线性化质粒p MSTN-ω3,302枚1~2细胞期胚胎显微注射后移植10头受体母猪,5头母猪妊娠,生产26头仔猪。PCR法检测得到4头转h Fat-1基因阳性猪,Southern印迹杂交分析验证1头猪整合有h Fat-1基因,1头猪近似整合h Fat-1基因。有1头h Fat-1基因整合猪可用于转基因猪育种,表达构件p MSTN-ω3能够用于生产转Fat-1基因猪。试验成功采用显微注射法制备转h Fat-1基因猪,改进、规范了胚胎原核显微注射法制备转基因猪的试验操作程序。     

猪生长激素cDNA在芽孢杆菌中的表达

利用随机克隆的枯草杆菌启动子-信号序列构建茅孢杆菌分泌载体pUS186。用限制酶将切除了信号序列的猪生长激素cDNA从质粒pLY3-PGH 604切下,亚克隆至pUS186,并在该cDNA的下游接上地衣杆菌α-淀粉酶基因的转录终止子,构建猪生长激素表达质粒pSGH 1864,将此质粒转化蛋白酶双缺陷的枯草杆菌DB104及短小茅孢杆菌289。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检出在发酵上清液中多出一条22kD的蛋白带,抗猪生长激素血清免疫印迹法证明这一蛋白带具有免疫活性,表明猪生长激素cDNA已在枯草杆菌及短小茅抱杆菌中表达。     

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素(pGH)基因的cDNA进行测序,得到pGH cDNA的全序列,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论.然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒pSXIVVI+X3/4构建出含pGH基因的重组质粒pX3/4-pGH.将pX3/4-pGH与致死缺失型线性化AcMNPV-OCC- DNA共转染Sf9细胞,构建出既能形成多角体又能表达pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV-pX3/4-pGH-OCC+.感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS-PAGE和Western blot的分析结果表明,感染细胞的蛋白电泳带的20.7 kDa处有一条猪生长激素特异带,但培养上清中没有.凝胶黑度扫描估测结果显示pGH蛋白占细胞可溶蛋白的4.48%.     

广西巴马小型猪presenilin-1基因克隆及多态性分析

本研究的目的是寻找广西巴马小型猪presenilin-1基因SNP位点,并确定各基因型频率。利用RT-PCR的方法扩增并克隆presenilin-1基因,通过测序和对比确定SNP位点,RFLP方法分析100头近交系和封闭群的广西巴马小型猪的基因组DNA,确定该突变位点的分布情况。结果显示,成功克隆广西巴马小型猪presenilin-1基因CDS区全长并确定T188C错义突变位点,SNP检测确定,在33头近交系中TT型占93.9%,TC型占6.1%;在67头封闭群中TT型占64.2%,TC型占35.8%,在封闭群和近交系中均未发现CC基因型。本研究成功验证了presenilin-1基因的SNP位点,为下一步研究presenilin-1基因T188C突变位点的功能奠定基础。     

猪垂体中猪生长激素基因的克隆和部分序列分析

从猪垂体中提取出DNA,以EMBL3噬菌体作裁体,构建了染色体基因文库。用全长的猪生长激素(pGH)cDNA作探针,经原位杂交,筛选出5个阳性克隆。提取其中一个阳性克隆的DNA,通过斑点杂交,酶解和Southern印迹,表明它含有全长猪生长激素基园,将sma Ⅰ酶解后soufhem印迹为阳性的两个片段进行了亚克隆,对其中含有猪生长激素基因sma Ⅰ位点上游序列的片段进行了部分序列分析,并和已发表的相应序列进行了比较。     

六个品种猪生长激素基因座位遗传多态性检测

我国具有丰富的猪品种资源,然而与国外猪种相比,我国地方猪种表现出生长速度慢、瘦肉率低的缺陷。而生长激素对调节动物的新陈代谢、加快生长速度、提高饲料报酬以及改善胴体组成等方面均有着重要的作用。猪的生长激素基因定位于１２号染色体Ｐ１４区域内,由５个外显子...     

苏姜猪及其杂交后代HSL基因PCR-RFLP分析

以苏姜猪、二元杂交猪（长白猪×苏姜猪、大白猪×苏姜猪）为研究对象,分别为60头,分析了HSL基因外显子Ⅰ区域PCR-RFLP多态性。结果表明,苏姜猪及其杂交后代群体中HSL基因外显子I中存在Bsa H I酶切片段长度多态性,均检测到AA、AB和BB基因型。苏姜猪群体中A等位基因占优势,频率为73.34%;杂交猪中B等位基因占优势,频率分别为56.66%和65.00%。研究结果丰富了苏姜猪的分子生物学研究,为苏姜猪的合理开发利用提供了依据。     

猪基因组文库的构建及其生长激素基因的分离

本工作以长白猪为材料,分别用Charon28及EMBL3为载体,构建了猪的基因组文库。用牛生长激素基因为探针对基因文库进行筛选,由两个基因文库中各获得一个阳性克隆λPGH1,λPGH2。其后,以质粒pUCl9为载体对λPGHl进行了亚克隆。通过对亚克隆pPGH的酶切图谱及其Southern杂交结果的分折表明,在pPGH中含有完整的猪生长激素基因。     

藏猪和大约克猪MYL1基因多态性及差异表达分析

为研究猪不同品种的MYL1基因的多态性及mRNA表达差异.本试验以藏猪和大约克猪作为实验动物,采用一代测序技术对藏猪(59头)和大约克猪(58头)MYL1基因起始密码子上游3 kb区域进行多态性检测;利用实时荧光定量PCR技术检测MYL1基因在背最长肌、背脂、肝脏组织差异表达情况.结果表明:藏猪和大约克猪在起始密码子上...