橡胶树凝集因子hevein基因及其启动子序列的分离与分析

橡胶树 (HeveabrasiliensisMuell._Arg .)凝集因子hevein是引起橡胶粒子凝集的主要因素 ,它是胶乳中黄色体内主要的蛋白质 ,具有几丁结合的功能。通过PCR技术扩增并克隆了橡胶树hevein基因共 6 80bp的序列。继而通过步移法分离启动子区域 130 6bp的序列 ,序列含典型的TATA盒和CAAT盒以及ABA效应元件的同源序列。为证实该基因在乳管中特异表达 ,利用Northernblot分析hevein基因在胶乳和叶片中的表达 ,同时 ,分析乙烯和ABA处理后hevein基因的表达。结果表明 ,hevein基因主要在胶乳中表达 ,乙烯和ABA对基因的表达有诱导作用。     

巴西橡胶树HbHEV3基因的克隆和表达分析

根据EST序列信息,通过RT-PCR获得了一个编码橡胶素前体的基因,命名为HbHEV3。HbHEV3编码区cDNA长度为630bp,编码209个氨基酸。预测的HbHEV3蛋白包含1个信号肽,1个具有几丁质结合特性的Hevein结构域和1个Barwinn结构域,HbHEV3与橡胶树及其他植物中类似蛋白具有很高的同源性。分离获得了HbHEV3起始密码子上游1 050bp的启动子序列,该序列含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量PCR分析结果表明,HbHEV3在所检测的组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高,乙烯诱导能显著上调胶乳中HbHEV3的表达。研究表明,HbHEV3可能参与了橡胶树乙烯介导的防御反应,并在橡胶凝集过程中具有重要功能。     

乙烯利诱导胶乳基因HbEtIe的克隆与表达分析

在成功构建巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个新的乙烯利诱导表达胶乳基因HbEtIe。分析表明,该基因含有1个158 bp的内含子和2个长度分别为92 bp和178 bp的外显子;cDNA全长551 bp,包含1个270 bp的完整阅读框,174 bp的3′-UTR和107 bp的5′-UTR,推导氨基酸序列中含有一个未知功能结构域DUF581。HbEtIe基因在乙烯利刺激条件下的胶乳中特异性表达并受到乙烯利的调控,其表达量随处理时间的延长而增强。HbEtIe基因与拟南芥衰老相关基因SAG102具有较高的同源性暗示,HbEtIe可能参与了乙烯利诱导巴西橡胶树乳管衰老的分子调控。     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

橡胶树DELLA蛋白编码基因HbGAI的克隆与表达分析

该研究采用RT-PCR与RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因HbGAI(GenBank登录号为KT696439)。HbGAI全长cDNA序列2 050bp,包含1个长1 842bp的完整开放阅读框。序列分析显示,HbGAI基因编码613个氨基酸,其推导的蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为66.476kD,理论等电点为5.19,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白。进化树分析表明,HbGAI蛋白与其他植物中DELLA蛋白具有较高的相似性,与麻疯树JcGAI和蓖麻RcGAI亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,割胶和茉莉酸甲酯处理下调胶乳中HbGAI基因的表达,乙烯利处理4h内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达,表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、茉莉酸、乙烯响应中发挥作用。     

巴西橡胶树一个编码含有C2结构域蛋白cDNA的克隆及表达分析

本研究根据从巴西橡树胶乳cDNA文库中获得的一个EST片段的序列信息设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码含有C2结构域蛋白的cDNA(命名为HbC2)。序列分析表明,HbC2长为1185bp,含有813bp的阅读框,140bp的5'-UTR和232bp的3'-UTR,编码270个氨基酸,分子量为30.9KD,等电点为6.29,含有保守的C2结构域。半定量RT-PCR分析表明HbC2在花、芽、叶、胶乳和树皮中都有表达,其中在胶乳中表达量最高。茉莉酸可抑制HbC2的表达,乙烯对HbC2的表达没有影响。此研究为进一步研究C2蛋白基因在橡胶树中的生物学功能奠定基础。     

巴西橡胶树HbMKK4基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’中克隆了1个促分裂原活化蛋白激酶的激酶(MKK)基因HbMKK4。该基因全长cDNA序列1 580bp,编码框1 059bp,编码352个氨基酸,含有S_TKc结构域,其编码蛋白的分子量为38.83kD,理论等电点为9.36。实时荧光定量PCR结果显示,HbMKK4在橡胶树的根、树皮、胶乳及叶片中均有表达。割胶、茉莉酸甲酯和乙烯利均能上调胶乳中HbMKK4基因的表达,基因相对表达量分别在割胶后2h、茉莉酸甲酯处理8h和乙烯利处理4h后达到最高。研究结果推测HbMKK4可能通过MAPK信号途径参与茉莉酸信号途径的响应,可能在天然橡胶生物合成调控中起关键作用。     

橡胶树胶乳高表达热激蛋白HbHSP90.4基因抗逆功能分析

为了分析热激蛋白90（HSP90）基因在橡胶树（Hevea brasiliensis）逆境胁迫和激素转导中的作用,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397胶乳中克隆得到HbHSP90.4基因全长cDNA序列,该基因含有1个2 451 bp开放阅读框（ORF）,编码816个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbHSP90.4含有HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域,属于HSP90家族成员。系统进化分析发现该蛋白与木薯MeHSP90具有较近的亲缘关系。亚细胞定位预测显示HbHSP90.4基因定位在内质网。qRT-PCR结果表明HbHSP90.4基因主要在橡胶树胶乳中表达。干旱、冷胁迫、橡胶树白粉菌侵染、H₂O₂和MeJA处理均可促进胶乳HbHSP90.4基因上调表达,而其在ETH、SA和ABA处理中均呈现显著下调表达。构建植物表达载体HbHSP90.4-mScarlet,为进一步的转基因植物的做成准备了材料。本研究为阐明胶乳HbHSP90.4基因响应橡胶树逆境胁迫过程和植物激素信号传导途径分子调控机制奠定坚实基础。     

巴西橡胶树HbCMK基因的克隆及表达

根据植物CMK(4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol Kinase,CMK)的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的CMK基因,命名为HbCMK.序列分析表明HbCMK长1 415 bp,编码388个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜菊(Stevia rebaudiana)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、烟草(Nicotiana benthamiana)和水稻(Oryza sativa)的CMK相似性分别达到72.6%、72.5%、71.9%、70.9%、69.0%和66.9%.半定量RT-PCR结果显示,HbCMK的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达,乙烯诱导胶乳HbCMK的表达,伤害对HbCMK的表达几乎没有影响.本实验结果为进一步了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和天然橡胶生物合成的调控奠定了基础.     

巴西橡胶树顺式异戊烯基转移酶基因cDNA克隆及其序列特征分析

以巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳的RNA为Tester;叶片RNA为Driver,利用抑制消减杂交法(suppressive subtractive hybridization,SSH)构建了一个胶乳特异表达基因差减文库.通过反式Northern点杂交(reverse Northern dot blots)筛选到一个与顺式异戊烯基转移酶基因(橡胶生物合成的关键酶基因)高度同源的阳性克隆R363.采用RACE方法获得该克隆的全长cDNA(GenBank登陆号:AY461414).序列分析表明,该基因长1156 bp,含有873 bp的阅读框,编码290个氨基酸,分子量约为32.9 kD,等电点为7.2,含有N-端跨膜螺旋区.同源性分析表明R363编码的蛋白质具有异戊烯基转移酶家族的特征,含有cis-异戊烯基链转移酶的5个高度保守区,推测R363可能是一种新的顺式-异戊烯基转移酶基因.Northern blot分析显示,R363在胶乳中高度表达,在叶中不表达.乙烯处理前后表达强度一致,表明该基因表达不为乙烯所诱导.     

甜菜夜蛾促前胸腺激素cDNA的克隆和表达

利用兼并引物扩增出甜菜夜蛾(Spodoptera exigua, Spe)的促前胸腺激素(prothoracicotropic hormone, PTTH) cDNA, 克隆和测序结果显示出PTTH cDNA编码226个氨基酸的开放阅读框: 包括信号肽、1个功能未知的肽和PTTH. 和其他已知物种的PTTH比较, 甜菜夜蛾和夜蛾科昆虫有较高的同源性, 和蚕蛾科和大蚕蛾科昆虫的相似性稍低, 但是PTTH分子中的7个半胱氨酸残基的位置是非常保守的. 整体免疫组织化学检测发现PTTH表达在甜菜夜蛾脑中的2对神经分泌细胞中. Northern杂交表明在脑中有高丰度的PTTH mRNA存在, 分子大小约为1.2 kb. 半定量RT-PCR检测了PTTH在幼虫期和蛹期的发育变化, 显示出PTTH表达和蜕皮变态有密切的关系, 暗示PTTH在甜菜夜蛾行使其生物学功能很可能是通过刺激前胸腺合成和分泌蜕皮激素来完成的.     

甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1编码区全长cDNA 的克隆与表达分析

通过筛选野生型油菜(Pet33-10)与无花瓣油菜(Apet33-10)反向消减文库(SSH)和运用RACE-PCR技术, 获得了甘蓝型油菜小核糖核蛋白BnSmD1的全长编码区 cDNA (GenBank登陆号DQ298446)。该基因长484 bp, 含有一个长354 bp的阅读框。BnSmD1在N端拥有两个高度保守的结构域(Sm-1和Sm-2), 羧基端则含有一个RG重复序列。Northern blot表达结果显示: BnSmD1在甘蓝型油菜的各个组织均有表达, 但是它在早期花蕾中的表达明显高于同期的叶和茎。通过对BnSmD1在Apet33-10无花瓣品系与野生型有花瓣品系Pet33-10中各组织的表达差异进行比较, 发现该基因在Apet33-10的早期花蕾中表达明显下降。因此, BnSmD1可能对植物的早期花发育起到了重要的作用, 并很有可能影响花瓣的形成。     

表达γ-亚麻酸的无筛选标记转基因大豆的鉴定

对所获得的9株无筛选标记基因的T1代莆豆8008转基因大豆的T2代进行了分析。PCR和Southern杂交检测表明标记基因已不存在于转基因株系中,同时目的基因以纯合或者杂合状态存在于部分株系中,除草剂抗性分析也表明这些转基因株系已不再具有抗除草剂的能力。Northern杂交检测表明Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因株系中可以转录。GC分析表明其中6个转基因植株富含GLA。     

Modulable Southern and Northern blot hybridization apparatus for routine screening of gene amplification and expression

An apparatus for Northern and Southern blot hybridization is described. It allows from one to twenty-four blots to be processed at the same time, with different probes. All the pre-, post- and hybridization steps are performed without handling the filters and the experimenter is totally protected from beta radiations.

The development of such modulable materials has become necessary since Southern and Northern techniques are becoming routine assays in hospitals, particularly in the field of oncology, in prognosis and for hereditary diseases, as an antenatal diagnostis procedure.     

Cloning and identification of a novel cDNA coding thioredoxin-related transmembrane protein 2

Thioredoxin plays an important role in various cellular processes through redox regulation. Here we report the molecular cloning and characterization of one member of the thioredoxin superfamily, designated as TMX2. The TMX2 cDNA consists of 1644 nucleotides and contains an open reading frame encoding a protein of 372 amino acids with a predicted molecular mass of 42.5 kDa and an isoelectric point of 8.94 . The TMX2 protein may possess an N-terminal signal peptide, a potential transmembrane domain, an Myb DNA-binding domain repeat signature, a thioredoxin consensus pattern, an endoplasmic reticulum (ER) membrane retention signal (KKXX-like motif), and a dileucine motif in the tail. Northern blot analysis shows it is widely expressed in human tissues.     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与序列分析

用逆Northern印迹和Northern印迹法进一步鉴定淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性品系胰蛋白酶的表达差异 ,结果显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中的表达量分别是敏感性品系的 4.3和 3.9倍。采用RACE法筛选cDNA文库 ,获得总长度为 90 9bp的淡色库蚊胰蛋白酶基因的全长序列 ,其中开放阅读框为 786bp ,推导出编码 2 6 1个氨基酸的蛋白质 (GenBank/NCBIAY0 34 0 6 0 ) ,其与冈比亚按蚊胰蛋白酶同源性最高 ,为 5 5 %     

Molecular Cloning and Characterization of a Leishmania donovaniα-Tubulin Gene

ABSTRACT. We have isolated a cDNA for an α-tubulin mRNA from L. donovani promastigotes and determined its complete nucleotide sequence. Both nucleotide and deduced amino acid sequence analysis of this cDNA showed significant similarity with a previously reported, partial sequence of an L. enriettii α-tubulin and the complete sequence of human α-tubulin. Further, the in vitro translated L. donovania α-tubulin gene product was specifically immunoprecipitated with a monoclonal antibody against human α-tubulin. Northern blot analysis revealed that there was little change in the expression of the L. donovani α-tubulin RNA during parasite differentiation from promastigote to the in vitro grown "amastigote" form. Southern blot analysis revealed a simple genomic organization for the L. donovani α-tubulin gene with more than one copy of the α-tubulin gene in the parasite genome. To our knowledge, this is the first complete sequence of an α-tubulin for Leishmania to be reported in the literature.     

DIG系统在Northern杂交中的应用

非放射性标记已越来越广泛地被应用于分子生物学的研究。本文介绍本实验利用ＤＩＧ高效ＤＮＡ标记系统进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ的经验,供同行参考。     

Molecular cloning, gene expression, and tissue distribution of adiponectin and its receptors in the Japanese monkey, Macaca fuscata

Background  Adiponectin is an adipocyte-derived hormone that affects regulation of metabolic syndrome such as insulin resistance, type-2 diabetes, and obesity. It functions via seven transmembrane domain receptors [i.e., adiponectin receptors 1 (AdipoR1) and 2 (AdipoR2)] that have been scarcely investigated in non-human primates.
Methods  Molecular cloning of cDNAs for adiponectin, AdipoR1, and AdipoR2 that included the whole protein-coding region in the Japanese monkey, Macaca fuscata , was carried out. Tissue-specific expression of respective genes was analyzed with Northern blot hybridization.
Results  The essential Cys36 and four lysine residues in adiponectin, and transmembrane-spanning domains in AdipoR1 and AdipoR2 appear well conserved. While adiponectin mRNA is expressed only in adipose tissues, AdipoR1 mRNA was found to be expressed in various tissues including the brain.
Conclusions  These results significantly add to the understanding of the molecular basis of obesity-related adipokines and their receptors in non-human primates.