橡胶树凝集因子hevein基因及其启动子序列的分离与分析

橡胶树 (HeveabrasiliensisMuell._Arg .)凝集因子hevein是引起橡胶粒子凝集的主要因素 ,它是胶乳中黄色体内主要的蛋白质 ,具有几丁结合的功能。通过PCR技术扩增并克隆了橡胶树hevein基因共 6 80bp的序列。继而通过步移法分离启动子区域 130 6bp的序列 ,序列含典型的TATA盒和CAAT盒以及ABA效应元件的同源序列。为证实该基因在乳管中特异表达 ,利用Northernblot分析hevein基因在胶乳和叶片中的表达 ,同时 ,分析乙烯和ABA处理后hevein基因的表达。结果表明 ,hevein基因主要在胶乳中表达 ,乙烯和ABA对基因的表达有诱导作用。     

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。     

巴西橡胶树 HbNAC1基因启动子的克隆及序列分析

NAC转录因子是植物特有的一类转录调控因子,在植物的生长发育、激素调节和境胁迫应答中具有重要的功能。为研究NAC转录因子在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)抗逆胁迫中的功能,本项目组根据巴西橡胶树NAC转录因子-HbNAC1基因序列,通过Genome Walking方法从巴西橡胶基因组DNA中获得了长度为1861bp的HbNAC1基因的5’调控区片段,序列分析表明该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点T位于起始密码子上游52bp处。该启动子序列除了含有TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还具有茉莉酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,这表明HbNAC1基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能,其启动子可能是一个光诱导型和组织特异性启动子。     

小麦醇溶蛋白盒结合因子基因启动子序列

1　Ｓｏｕｒｃｅ　Ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｆｒｏｍａｒｅ ｖｅｒｓｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ,ｗｈｉｃｈｗａｓｌｉｇａｔｅｄｔｏｐＭＤ1 8 Ｔｖｅｃｔｏｒ(ＴａＫａＲａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ .) ,ｆｒｏｍｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｏｍｉｃＤ     

启动子探针载体的构建及橡胶树白粉菌启动子筛选鉴定

旨在构建适于快速检测橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)HO-73启动子的探针载体。以卡那霉素抗性基因Kan作为报告基因,在pUC19骨架载体,构建获得启动子探针载体pUC19-K,连入CaMV35S启动子做启动子探针载体功能验证;利用启动子探针载体pUC19-K对预测的启动子片段LY1、LY2、LY3、LY4进行筛选鉴定。将CaMV35S启动子连入到启动子探针载体中,得到可检测启动子活性的启动子探针载体pUC19-K;应用生物信息学软件对部分橡胶树白粉菌HO-73全基因组数据预测,得到4个理论上具有活性的启动子序列LY1、LY2、LY3、LY4,利用构建的启动子活性探针载体进行活性比较,卡那耐受性实验检测发现含LY2和LY3的菌株随卡那霉素浓度的升高耐受性更强,最终得到2个活性较强的启动子LY2和LY3。以上结果表明,构建的启动子活性探针载体可以有效、灵敏地用于HO-73强启动子的筛选和启动子活性检测。     

组蛋白与转录因子在hAMFR基因启动子序列上的结合及相互作用

采用从鸡红细胞中分离纯化的组蛋白Ｈ１,核心组蛋白Ｈ２Ａ＋Ｈ２Ｂ和Ｈ３＋Ｈ４,以及从ＨｅＬａ细胞中萃取的含有ＲＮＡ聚合酶Ⅱ和多种Ⅱ类基因转录因子的可溶性ＨｅＬａ细胞核抽提物,通过凝胶迟滞电泳,对组蛋白和ＨｅＬａ细胞核抽提物中的转录因子在人自泌移动因子受体（Ｈｕｍａｎａｕｔｏｃｒｉｎｅｍｏｔｉｌｉｔｙｆａｃｔｏｒ,简称ｈＡＭＦＲ）基因上游启动子序列的相互作用关系进行了初步研究,得到以下结论,组蛋白Ｈ１     

橡胶树蒸腾特征及其与环境因子的关系

于2013年2—11月,应用Granier热消散探针对西双版纳地区橡胶树蒸腾进行了连续观测,并同步测定了环境因子(光合有效辐射(PAR)、气温、相对湿度和土壤含水量),结果表明:橡胶树蒸腾速率为昼高夜低的单峰曲线,晴天平均蒸腾速率、蒸腾量是雨天的4倍之多;雨季蒸腾启动时间较干季提前0.5～1.0 h、峰值时间较干季提前2.0～4.5 h,观测阶段日平均蒸腾量为27.84 kg·d-1;4月蒸腾量最大,其值为54.3 mm,11月蒸腾量最小,其值为29.6 mm。干季环境因子对蒸腾速率影响的大小顺序为:气温相对湿度PAR土壤含水量,雨季为:PAR相对湿度气温土壤含水量。干季橡胶林出现水分亏缺,但橡胶树通过其发达的根系可以获取深层土壤水,因此未对其造成严重的水分胁迫。     

青杄转录因子PwNAC30及其启动子序列的克隆与表达分析

该研究以青杄(Picea wilsonii)为实验材料,通过PCR从青杄的cDNA文库中克隆得到一个NAC转录因子,命名为PwNAC30。生物信息学分析显示,PwNAC30开放阅读框1 179bp,共编码392个氨基酸,在其N端存在保守的NAM(no apical meristem)结构域,可分为A～E等5个亚结构域。多序列对比和系统进化树分析显示,PwNAC30蛋白与同为云杉属的北美云杉(Picea sitchensis)聚为一类。启动子克隆分析显示,PwNAC30基因启动子上存在脱落酸(ABA)、赤霉素(GA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、TC-rich repeats等激素和逆境响应元件,在GA、ABA、MeJA、低温、干旱、盐的处理下,其启动子活性均明显增强。荧光定量PCR分析表明,PwNAC30在球果中的表达量最高,而在花粉和种子中的表达量最低。PwNAC30对于盐、干旱、低温、ABA、MeJA、GA处理均有响应,尤其对盐、干旱、MeJA的响应最为显著。亚细胞定位结果显示,PwNAC30蛋白定位于细胞核与细胞质,主要定位于细胞核中。酵母单杂及双杂结果表明,PwNAC30蛋白的全长和N端没有转录激活活性,而C端有转录激活活性,且PwNAC30自身能形成同源二聚体。研究表明,青杄PwNAC30基因可以作为一个转录因子发挥作用,其转录激活活性在C端,且自身能够形成同源二聚体结构;PwNAC30基因广泛参与了ABA、GA、MeJA等激素的信号通路,并对盐、干旱、低温处理有响应。     

小麦TaPSG719基因启动子的分离及序列分析

TaPSG719基因是从小麦中分离的花粉特异性表达基因,其功能未知.克隆和分析该基因的启动子有助于研究该基因的功能,解析小麦花器官的发育调控机制.本研究根据已报道的TaPSG719基因cDNA序列为基础设计引物,经过两次反向PCR获得了该基因起始密码子上游1776 bp的调控序列.应用PLACE和PlantCARE数据库系统对该序列进行分析研究,发现其具有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box、两种花粉特异性调控元件AGAAA和GTGA及光反应和激素响应元件.     

橡胶延伸因子基因及3'端非编码区的克隆与序列分析

橡胶延伸因子ＲＥＦ（Ｒｕｂｂｅｒ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）是橡胶生物合成中最重要的酶之一．作者利用ＲＥＦ基因序列设计并合成引物． 通过提取胶乳总ＲＮＡ 用ＲＴ法合成ｃＤＮＡ 后,通过ＰＣＲ技术扩增并克隆了ＲＥＦ基因和３端非编码区． 序列测定结果表明,ＲＥＦ基因全长４１４ 个碱基,编码１３８ 个氨基酸,３端非编码区长１１２ ｂｐ． 与Ｇｏｙｖａｅｒｔｓ Ｅ 等人发表的序列比较：ＲＥＦ基因同源率为１００％ ,３端非编码区有２ ｂｐ 的差异,同源率为９８％ ． 将所克隆的ＲＥＦ基因及３非编码区进行地高辛标记, 对胶乳和叶片总ＲＮＡ 进行点杂交分析,结果表明,胶乳总ＲＮＡ 呈阳性反应,叶片总ＲＮＡ 则呈阴性反应．     

辽宁碱蓬甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)启动子分离及序列分析

根据已知的辽宁碱蓬BADHcDNA5′端序列设计两个基因特异的反向引物(BR1,BR2),通过衔接头PCR获得了BADH基因起始密码子上游265bp的序列。根据所获得的序列设计两个基因特异的反向引物(BR3,BR4),用BR2、BR3、BR4分别与4个简并引物配对,通过TAILPCR扩增,获得了约2kb的序列。经Sequencer软件拼接上述两段序列,获得了BADH基因起始密码子上游2055bp的序列。用TSSPTCM软件分析此序列,预测出转录起始点(T)位于起始密码子上游62bp处,由此获得了1993bp的SlBADH启动子序列。用PLACE软件分析此序列,发现该序列具有启动子的基本元件TATAbox、CAATbox,包含多个胁迫诱导元件,如盐诱导元件GAAAAA,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件CANNTG,伤害诱导元件ANATTNCNN,热激元件ATAAATGT等,是一个强的胁迫诱导启动子。     

香蕉凝集素基因启动子的分离、序列分析及鉴定

香蕉是世界上最重要的水果之一,由于香蕉果实是利用转基因方法生产重组药用蛋白或有价值的化合物的理想器官,构建能在香蕉果实中高水平表达异源蛋白质的表达载体是非常有意义的。而一个高效表达的载体,启动子则是其最重要元件之一,因此,果实特异性表达启动子的获得是香蕉作为生物反应器的前提。香蕉凝集素是一种在香蕉果实中大量存在的蛋白质,其基因被证明在果肉组织中大量表达。利用染色体步移法克隆到香蕉凝集素基因5′端上游的一段长702bp的序列,经序列测定及软件分析表明,该序列具有典型的启动子结构。此序列置换植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子,构建植物表达载体,命名为pBIL2,该启动子下游为gus基因。利用基因枪法转化香蕉的根、叶和果实薄片,对gus基因的瞬时表达进行测定,结果表明所获得的凝集素基因启动子,只在香蕉果肉中瞬时表达,该启动子的表达具有果实特异性,并且表达量较高。     

白桦BpbHLH112基因克隆及其启动子表达特性分析

克隆白桦BpbHLH112基因的编码序列，并进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在不同胁迫处理下的表达模式，进一步克隆了BpbHLH112基因上游1 446 bp的启动子区域，序列分析表明，该区域含有多个逆境响应、激素响应以及信号转导等相关元件，通过构建BpbHLH112启动子片段融合GUS报告基因的表达载体并进行烟草瞬时转化，分析在不同胁迫处理条件下BpbHLH112启动子驱动GUS基因表达的活性，结果表明BpbHLH112启动子的表达能够被一些逆境胁迫因子诱导，本研究结果为深入研究BpbHLH112调控白桦应对非生物胁迫作用的分子机理提供了理论依据。     

拟南芥亚硫酸盐氧化酶基因AtSO启动子的分离与功能分析

亚硫酸盐氧化酶(SO)作为目前发现的钼酶家族成员之一,在哺乳动物硫化物的脱毒、嘌呤代谢等过程中起着非常重要的作用。然而,很少有关于高等植物SO的表达和调控机制的研究报道。本研究中,我们用半定量RT-PCR和组织化学方法对拟南芥中SO基因AtSO的表达调控进行了初步研究。结果表明,AtSO在拟南芥的地上部分如茎、叶、花和未成熟荚果中有较高的表达水平,而在根部表达水平较低。在对分离的该基因上游1562-bp的启动子区域进行生物信息学分析时,鉴定出一些可能的调控元件如光调控元件(LRE)。转基因植株中AtSO启动子驱动下的GUS基因(uidA)表达结果表明:AtSO的表达主要在植物的地上组织,表达具有光依赖性,且表达水平受亚硫酸盐的诱导增高。这一结果对进一步研究SO在植物对光周期和亚硫酸盐胁迫应答反应中的作用提供线索。     

粘虫核型多角体病毒凋亡抑制基因的定位,序列和启动子结构

以ＡｃＮＰＶ凋亡抑制基因ｐ３５为探针,与ＬｓＮＰＶＤＮＡ的限制性片段和ＬｓＮＰＶＤＮＡＥｃｏＲＶ片段杂交,发现ＥｃｏＲＶ５．５ｋｂ片段有强烈的杂交信号。将此片段亚克隆后,测定了１２４４ｂｐ序列,发现一个完整的ＯＲＦ,推导的３０２个氨基酸与ＡｃＮＰＶｐ３５蛋白有７０．４％的氨基酸同源性,证明所测ＯＲＦ为ＬｓＮＰＶ的ｐ３５基因。结构分析发现其５′端有早期基因启动子元件ＧＣ、ＡＣＧＴ和ＴＡＴＡｂｏｘ。有２２ｂｐ的顺向重复序列,包括由两个重叠的ＴＡＴＡｂｏｘ和上下游两个ＡＣＧＴｍｏｔｉｆ组成的两套启动子元件,这些结构特征与ＡｃＮＰＶ的凋亡抑制基因十分相似。     

淡色库蚊抗药性相关胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与序列分析

用逆Northern印迹和Northern印迹法进一步鉴定淡色库蚊对溴氰菊酯抗药性和敏感性品系胰蛋白酶的表达差异 ,结果显示 ,胰蛋白酶基因在抗药性品系中的表达量分别是敏感性品系的 4.3和 3.9倍。采用RACE法筛选cDNA文库 ,获得总长度为 90 9bp的淡色库蚊胰蛋白酶基因的全长序列 ,其中开放阅读框为 786bp ,推导出编码 2 6 1个氨基酸的蛋白质 (GenBank/NCBIAY0 34 0 6 0 ) ,其与冈比亚按蚊胰蛋白酶同源性最高 ,为 5 5 %     

一种强启动子的分离与功能

以棉花曲叶病毒（ＣＬＣｕＶ）侵染的番茄叶片组织总ＤＮＡ为模板,通过ＰＣＲ反应扩增ＣＬＣｕＶ双向启动子片段并插入克隆载体。序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长４３６ｂｐ,与目前发现的４类ＣＬＣｕＶ分离物的启动子序列的同源性最高为９９．３２％。将启动子片段分别以不同方向与ｇｕｓ报告基因和ｎｏｓ终止子融合,构建了瞬时表达载体。通过基因枪法将质粒载体导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）     

甘蓝型油菜BnGOLS1基因启动子的克隆、序列分析及瞬时表达

以甘蓝型油菜‘德油五号’基因组DNA为模板,通过反向PCR扩增得到肌醇半乳糖苷合成酶基因（BnGOLS1）启动子片段,长度为827bp。PLACE和PlantCARE启动子预测工具分析表明：序列中含有TATA-Box、CAAT-Box等基本转录元件,以及ABRE、DRE、HSE、w-Box等顺式作用元件。将克隆得到的BnGOLS1启动子取代pBI121中的CaMV35S启动子,构建BnGOLS1启动子控制报告基因的GUS表达载体pBI-GS-GUS,通过农杆菌介导的方法在油菜组织中进行瞬时表达。GUS染色结果表明BnGOLS1启动子可以驱动GUS基因在油菜组织中的表达。