ELISA检测流行性乙型脑炎病毒的研究——Ⅲ.联合应用微量细胞培养和ELISA法鉴定临床标本中流行性乙型脑炎病毒

临床疑似流行性乙型脑炎(简称乙脑)病人的血浆和脑脊液共41份,接种C6/36(白纹伊蚊纲胞系)培养后,用ELISA双夹心法检测培养液中乙脑病毒(JEV),其中16份(血浆和脑脊液各8份)为阳性,阳性率为39.5％。14份阳性标本按种小白鼠脑内后均出在典型症状而死亡,取脑组织作中和试验鉴定,表明14份病毒标本均为JEV。8例血浆病毒阳性者中7例血清IgM抗体阳性。说明本法检出的JEV是特异性的。可用于病毒的特异性快速鉴定。     

单克隆抗体治疗日本脑炎病毒感染恒河猴的实验研究

感染日本脑炎病毒(JEV)的恒河猴,出现脑炎的一系列症状与体征,终因呼吸及循环衰竭而死亡。JEV感染猴体温升到超过39℃以上后的第2天,注射单克隆抗体(McAb)制剂进行实验性治疗。结果显示,McAb经肌肉、静脉、硬脑膜下加肌肉等不同途径注射后,均有良好的疗效,对恒河猴的保护率达100％,其中以硬膜下加肌肉途径注射McAb的效果最佳。多次注射McAb,未发现任何不良反应与毒副作用。本研究表明,将鼠源性McAb用于灵长类安全可靠,若过渡到临床使用,是可行的。     

蛇瓜提取物的抗病毒感染作用和诱生干扰素的活性

本实验证明,在流行性乙型脑炎病毒皮下感染前,给小白鼠注射蛇瓜提取物(简称E.T.a.)有明显的保护作用;在感染后给药,则小白鼠存活天数可明显延长,但其保护作用低。给家兔静脉注射E.T.a.,血清中可测到Ⅰ型干扰素,高峰出现在注射后2小时。经初步鉴定,蛇瓜提取物的有效成份似为某种双链RNA,但需进一步确证。     

呼吸道合胞病毒融合抑制活性单克隆抗体的鉴定及应用

用杂交瘤技术制备了抗呼吸道合胞病毒 (RSV Long株 )的单克隆抗体F3细胞株。经IFA及ELISA证明 ,F3株McAb对RSV抗原特异 ,具中和活性及融合抑制活性 ,其腹水中和效价和融合抑制效价分别为 1∶12 8和 1∶6 4。将F3株McAb与商售混合单抗试剂盒进行临床诊断比较 ,二者阳性符合率 96 .9% ,阴性符合率 10 0 %。     

流行性乙型脑炎目动免疫的买验研究II．小白鼠免疫后的保护力与攻击途径的关系

本文研究了小白鼠经流行性乙型脑炎疫苗免疫后对脑内与皮下攻击的保护力。此外,也进行了抗体水平与保护力关系的研究。实验证明小白鼠经一次脑炎疫苗免疫后虽然对脑内攻击没有保护力或保护力很低,但在皮下攻击时可以观察到小白鼠有很强的保护力,而且在免疫后一、=天时对少量病毒的皮下攻击已有保护现象。脑炎疫苗二次免疫小白鼠后,小白鼠不仅对皮下攻击有很高的保护力,而且对脑内攻击也能表现有保护现象,其保护指数不仅与疫苗量有关,而且与注射嗣隔有关,一般注射间隔短者其保护力较低,注射间隔长者其保护力则较强。实验并就明免疫的小白鼠对脑内攻击的保护力持续时间不长,而在血液中的中和抗体持续时间较久。最后,本文对机体的保护力与戚染途径的密切关系进行了讨论。     

巨细胞病毒单克隆抗体的建立和应用

应用人巨细胞病毒(CMV)AD169株免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,得到4株(12H、3H、47C和6H)能分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞。其中47C株McAb(滴度≥512 000)经辣根过氧化物酶标记,能与细胞培养中的AD169株和Davis株CMV发生特异性核内染色反应。14份出现CMV典型病变的临床阳性标本中,12份呈明显的阳性反应,另2份为弱阳性反应,而对正常细胞及感染其它病毒的细胞均无染色反应,说明该McAb具有较好的特异性。用于鉴定分离的毒株,一天内可出结果,比中和试验快速、简便。     

用体外免疫法建立人—人抗流行性乙型脑炎病毒杂交瘤细胞株

利用单克隆抗体(McAb)进行病毒病的治疗是人们所关心的一个重大课题。 流行性乙型脑炎(乙脑)是一种严重威胁人民健康的急性传染病,病死率高,后遗症严重。国内外目前尚无特效疗法。陈伯权等用乙脑病毒皮下或腹腔感染3周龄小白鼠24、48小时及5天后,分别用乙脑病毒51-8McAb进行治疗,平均治愈率分别为78％、73％及22％。     

单纯疱疹病毒致病模型的研究

对单纯疱疹病毒（HSV）感染小白鼠致病特点进行了观察。小白鼠感染HSV第4天后开始发病,感染后2h血液内可分离出病毒,第48小时病毒血症水平和病毒检出率较高。不同组织病毒分布不同,脑、神经节在感染后第72小时病毒滴度较高,心、肝组织在第5天达到高峰。结果说明所建立的HSV致病模型可用于评价抗HSV药物。     

一株封小白鼠皮下感染有高度致死力的流行性乙型脑炎病毒京卫研株与中山株感染力的比较

以流行性乙型脑炎病毒京卫研,株舆中山株在各种途径感染的致死力进行了比较试验,结果表明： (一)雨株病毒对不同鼠龄的小白鼠脑内接种感染致死力没有明顯差别,但在脑外途径(皮下和腹腔)接种感染的致死力则随鼠龄的增加而下降。 (二)京卫研,株病毒封小白鼠具有高度的皮下感染的致死力,而中山株则很低。     

森林脑炎病毒对鸡胚单层细胞的致病变作用及其实际应用

从人尸脑组织或蜱分离出的森林脑炎病毒株感染鸡胚皮肤肌单层细胞时,均可出现明显的细胞病变TCID50滴度与小白鼠脑内毒力LD50相一致,可达log 7.0—9.0。病毒如加有被确诊的森林脑炎病人恢复期血清或者免疫动物血清则不出现病变,证明细胞病变作用的特异性。病毒经鸡胚细胞传代后仍保持稳定的致病变作用。应用鸡胚细胞作血清中和试验与小鼠腹腔接种法中和试验测定的抗体结果相一致,而其敏感性和特异性都高于用小鼠法所测结果。本文对森林脑炎病毒在鸡胚细胞引起病变的条件和影响因素及其实际应用价值加以讨论。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和EUSA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出,E39(306TEKFSFAKNPVDTGHG320)、EA5-l(355VTNPFVATSSA366)、FA8-1(377FGDSYIV384)和E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)4个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明,E39为具有病毒中和活性的抗原表位.试验结果为进一步分析JEVE蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.     

乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒(JEV)SA14株基因序列设计一套引物 ,利用长模板RT-PCR 技术,一次扩增出了JEV的全长cDNA,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的RNA聚合酶启动子下游.阳性克隆转录的RNA转染HBK细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为JEV,这一结果表明JEV感染性克隆的构建获得了成功.其次,合成一条含有 RNA聚合酶启动子序列的5′引物,利用长模板RT-PCR方法扩增出带有启动子的JEV全长cDNA ,以此cDNA为模板作体外转录.转录产物转染BHK细胞后观察到了典型的JEV病变.收获的病毒经乳鼠脑内接种及免疫荧光染色证明为JEV,从而建立了制备JEV感染性RNA的快捷方法.本研究构建的JEV感染性克隆与建立的长模板RT-PCR快速制备JEV感染性RNA的方法,将为JEV 分子生物学研究的后续工作提供有力的工具和奠定坚实的基础.     

MicroRNA调控乙型脑炎病毒复制及发病机制的研究进展

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是具有严重危害的人畜共患病病原,感染人后入侵中枢神经系统,致死或者留下永久性神经系统后遗症。JEV还可以感染猪群,造成种猪繁殖障碍,仔猪脑炎,给养猪业带来损失。MicroRNA作为一种在转录后水平发挥基因调控功能的非编码小分子RNA,参与到细胞生长、分化、凋亡和代谢等生命过程,并且在病毒感染入侵及宿主细胞的抗病毒方面起着重要的调节作用。此文综述了当前已证实的microRNA对JEV复制及发病机制的调控作用研究。了解宿主microRNA在JEV感染过程中的可能导致识别阻断JEV复制或细胞特异性调节病毒载体靶向的新机制,并提出了防控JEV的可能途径。     

流行性出血热病毒灭活后免疫原性的初步研究

本文用较高感染滴度的Vero-E6细胞和小白鼠乳鼠脑病毒,经56℃1小时加温或1:2,000福尔马林灭活后,免疫成年小白鼠、黑线姬鼠和长爪沙鼠。结果Vero-E6细胞培养的病毒均未使动物产生可测出的抗体,而小白鼠乳鼠脑病毒则获得良好的抗体阳转率(92％)。同时证明,热灭活较福尔马林灭活者好,加佐剂较不加佐剂好。     

云南森林脑炎病毒的动物敏感性研究

本文对分离自云南的森林脑炎病毒进行了动物敏感性研究,实验证明云南森林脑炎病毒对小白鼠有较强的致病性,三日龄乳鼠无论经脑内、腹腔、皮下接种均能致病、死亡,但毒力较国内森林脑炎病毒标准株低;三周龄小白鼠经鼻腔接种亦能发病致死。对乳大白鼠、幼年豚鼠和金黄色地鼠能引起发病或死亡,病毒抗原定位主要在脑组织。病理检查表明感染的各种动物脑组织均有明显病变。此外,对鸡胚敏感,能引起BHK_(21)、Vero、Vero-E_6等传代细胞及人胚肾、乳猪肾原代细胞的CPE_0结果表明了云南森林脑炎病毒对细胞、动物的致病性与国内森林脑炎病毒标准株相似,仅毒力稍低。     

我国流行性乙型脑炎病毒毒力和抗原性的研究

流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的毒力,多与毒株的大小空斑数的比例有关;同株内大斑小斑的特征各异。60年代和80年代的乙脑毒株,其毒力无明显差异。单克隆抗体(McAb)51～8对15株乙脑病毒的中和指数(log10)为:6.05～6.25者3株,5.08～5.67者5株,4.0～4.67者4株,1.95～3.83者3株。这种差别与毒株的分离年份和地区无关。多克隆抗体(PcAb)的中和指数(log10):5.0～5.33者11株,4.0～4.73者4株。可见McAb能较好地反映乙脑毒株的抗原性差别。文中讨论了毒力检查和McAb抗原分析的流行病学和免疫学意义。     

流行性乙型脑炎病毒的变异V．活疫苗弱毒株的生物学特性

继以前的工作,我们选择SA14-A弱毒变异株中的12-1-7号蚀斑病毒继续进行减毒和蚀斑纯化,获得了二株高度减毒而且毒力不易回升的弱毒株,其中一株5—3株的免疫原性较好,经人体免疫观察证明是安全有效的。5—3株的主要生物学特性如下： 1．在地鼠肾细胞内繁殖引起明显的细胞病变作用,病毒滴度一般可达10-6—10-7(TCID50／0．2毫升)。在琼脂覆盖下的鸡胚单层细胞内形成小于0．1厘米大小的点状蚀斑,蚀斑内细胞未完全破坏死亡。 2．对3周龄小白鼠和2—3公斤恒河猴脑内接种不引起发病和死亡,脑内病理改变较原强毒株显著减轻而且局限。 3．对1-3日龄乳小白鼠,无论脑内或皮下注射均有致病力,但致病力显著减弱,引起乳鼠死亡的毒力(LD50),脑内在3.0对数以下,皮下在2．0对数以下。 4．对3周龄小白鼠皮下注射,病毒只能在周围脏器内轻度繁殖随即消亡,而不能侵入脑内繁殖,脑组织内分离不到病毒,亦不引起病理改变。 5．在组织培养细胞内连续传10代,或在小白鼠脑内传3—5代,其残余毒力无明显回升。 6．对小白鼠皮下一次免疫后表现有较强的保护力。对豚鼠皮下免疫一次后表现有明显的中和抗体产生,阳转率为70—80％。1967年以来对5—3株进行了人群逐步扩大接种观察,结果未发现活疫苗引起的发热 反应和其他异常反应,人体抗体的阳转率为85—91％,人群流行病学效果保护率一般为80—90％,证明活疫苗是安全和有较好的免疫效果。但是5—3株尚存在着病毒滴度下降快,疫苗不稳定,需冷藏保存等缺点,因而往往影响疫苗大面积人体使用效果,需要进一步改进提高。     

树鼬对森林脑炎病毒的敏感性及发病机理的研究

从云南新分离森林脑炎病毒(YH和T57)及东北株经脑内、皮下及腹腔感染成年中国云南树鼩,均发生病毒血症。持续时间为7—9天。抗体应答反应和病理改变程度成反比,病变轻的能产生较好的免疫应答。血凝抑制抗体、中和抗体和补体结合抗体分别于感染后的第5、7、13天出现,且血凝抑制抗体和中和抗体的升高呈正相关。经抗原定位研究发现,腹腔注射后48小时,各组织器官均能查到抗原,除中枢神经系统外,其它组织内病毒抗原消失都很快,随病毒血症的消失而转阴,中枢神经系统携带抗原可持续27天,且病变随病程的延长而加重,表现为充血、血管周围淋巴细胞呈套状浸润,局灶性出血,神经元变性,胶质细胞增生,轴索断裂等,说明靶器官是中枢神经系统。试验表明,成年中国云南树勉对森林脑炎病毒比较敏感,是森林脑炎病毒动物模型研究首选动物。     

树Ju对森林脑炎病毒的敏感性及发病机理的研究

从云南新分离森林脑炎病毒（YH和T570及东北株经脑内、皮下及腹腔感染成年中国云南树Ju,均发生病毒血症,持续时间为7－9天。抗体应答反应和病理改变程度成反比,病变轻的能产生较好的免疫应答。血凝抑制抗体、中和抗体和补体结合抗体分别于感染后的第5、7、13天出现,且血凝抑制抗体和中和抗体的升高呈正相关。经抗原定位研究发现,腹腔注射后48小时,各组织器官均能查到抗原,除中枢神经系统外,其它组织内病毒抗原消失都很快,随病毒血症的消失而转阴,中枢神经系统携带抗原可持续27天,且病变随病程的延长而加重,表面为充血、血管周围淋巴细胞呈套状浸润,局灶性出血,神经元变性,胶质细胞增生,轴索断裂等,说明靶器官是中枢神经系统。试验表明,成年中国云南树Ju对森林脑炎病毒比较敏感,是森林脑炎病毒动物模型研究首选动物。     

树鼯对森林脑炎病毒的敏感性及发病机理的研究

从云南新分离森林脑炎病毒（YH和T57）及东北株经脑内、皮下及腹腔感染成年中国云南树鼯,均发生病毒血症,持续时间为7-9天。抗体应答反应和病理改变程度成反比,病变轻的能产生较好的免疫应答。血凝抑制抗体、中和抗体和补体结合抗体分别于感染后的第5、7、13天出发,且血凝抑制抗体和中和抗体的升高呈正相关。经抗原定位研究发现,腹腔注射后48小时,各组织器官均能查到抗原,除中枢神经系统外,其它组织内病毒抗原消失都很快,随病毒血症的消失而转阴,中枢神经系统携带抗原可持续27天,且病变随病程的延长而加重,表现为充血、血管周围淋巴细胞呈套状浸润,局灶性出血,神经元变性,胶质细胞增生,轴索断裂等,说明靶器官是中枢神经系统。试验表明,成年中国云南树鼯对森林脑炎病毒比较敏感,是森林脑炎病毒动物模型研究首选动物。