可视化牛传染性鼻气管炎病毒快速检测

【背景】牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)是牛常见的易感病原体,给畜牧业带来了重大经济损失,亟须建立一种快速检测IBRV的方法。【目的】建立一种重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)和微流控芯片技术相结合的IBRV可视化快速检测方法。【方法】实验选择IBRV的ul52基因作为分子检测的目标片段。选择伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、鸭瘟疱疹病毒作为对照组。通过不同稀释倍数IBRV的DNA提取液确定灵敏度。通过对34份疑似感染IBRV急性期病牛的血清和鼻拭子样本病原分离株的检测来分析本方法的适用性。【结果】ul52基因扩增子大小为403 bp,扩增子测序结果显示,得到的目标片段核酸序列与IBRV的ul52基因(NC_063268.1)相似性达100%,对照组未见扩增子,检测限为6.9×10³ copies/µL。对34份疑似感染IBRV急性期病牛血清和鼻拭子样本病原分离株的检测结果分析发现,编号分别为SD0213、SD0518和SD0701的牛感染了IBRV,血清和鼻拭子样本病原分离株检测结果一致。另外,从样本DNA提取到获得检测结果的全流程时长为110 min。【结论】本研究将RPA、磁性探针捕获和微流控技术相结合,建立了一种IBRV病毒的快速可视化分子检测方法,该方法具有良好的特异性和灵敏度。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上,构建了含有ILTV gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞后,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒(rFPv-gB-F),并进行了6轮蚀斑纯化。Western-blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTV gB基因和NBVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒的繁殖的冰冻蚀刻研究

用冰冻断裂和蚀刻技术对牛传染性鼻气管炎病毒及其在细胞中的繁殖进行了观察。验证了Furlong等提出的疱疹病毒核壳体模型;同时发现在细胞膜上大片形成吞饮泡,细胞质泡状结构的膜上颗粒随机分布于PF和EF面． 本文对这些现象与病毒繁殖及细胞骨架的关系进行了讨论。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提 ,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上 ,构建了含有ILTVgB基因和新城疫病毒 (NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F ,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维 (CEF)细胞后 ,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒 (rFPV-gB-F) ,并进行了 6轮蚀斑纯化。Western blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTVgB基因和NDVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

培养山羊痘病毒常用细胞在X-gal环境中的显色差异分析*

目的：为筛选出表达LacZ基因重组山羊痘病毒的适宜培养细胞系。方法：将常用于培养山羊痘病毒(GPV)的乳仓鼠肾细胞(BHK21)、羊肾细胞(SK)和羔羊睾丸细胞(LT)培养至单层,之后单层细胞用含X-gal的培养基继续培养,观察比较各细胞在X-gal环境中呈现的蓝色。提取单层细胞的RNA,进行LacZ基因的RT-PCR,回收PCR产物、连接载体、转化E.coli,挑阳性克隆测序分析。将单层细胞继续培养72 h,检测各细胞产生的β-半乳糖苷酶。结果：随着培养时间的延长,固体培养的BHK21、LT细胞孔中胶颜色变蓝且逐渐加深,显微镜观察可见细胞蓝斑,而SK细胞、空白、无X-gal孔中的胶未变色,镜检无细胞蓝斑;液体培养的单层细胞逐渐脱壁,培养液未见蓝色。RT-PCR产物电泳条带与预期分子量大小相符,测序结果显示目标DNA与LacZ基因序列相似性值达100%,表明3种细胞均有LacZ基因的转录本。β-半乳糖苷酶测定结果显示3种细胞均表达此酶,细胞产酶能力比较为BHK21>LT>SK,尤以SK细胞产β-半乳糖苷酶量极低。结论：显色差异法筛选出的羊肾细胞适宜培养表达LacZ基因的重组山羊痘病毒,结果可为山羊痘病毒新型疫苗研发提供一些参考。     

表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究

利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础。     

鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白G对病毒吸附、侵入、复制和细胞间接合传染的影响

利用分离纯化的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)天然糖蛋白G及其制备的抗体处理, 测定对ILT病毒(E3毒株和Zhonghai毒株)吸附、侵入、复制和病毒从细胞到细胞直接感染的影响. 结果证明, ILTV天然糖蛋白G及抗糖蛋白G抗体对病毒的吸附和侵入无明显影响. 添加糖蛋白G对病毒从CEL细胞到CEL细胞直接感染和病毒在CEL细胞上的复制的影响不明显, 但添加抗糖蛋白G大鼠IgG却显著抑制病毒的复制, 表现为噬斑变小, 病毒复制曲线降低. 激光共聚焦扫描显微镜观察结果显示ILTV糖蛋白G存在于鸡原代肝细胞核外周质及细胞膜上, 并且糖蛋白G聚集在细胞融合部位. 推测糖蛋白G可能促进了细胞的融合或参与病毒从细胞到细胞的直接感染, 从而影响病毒复制和噬斑的形成.     

低温常压等离子体提高MDBK细胞中IBRV病毒滴度的作用与机制研究

加强病毒的繁殖可以帮助MDBK细胞生产更多的IBRV病毒用于生产灭活病毒疫苗。已证明低温常压等离子体（Cold atmospheric plasma,CAP）是一种依靠活性氧来实现MDBK细胞中病毒显著增殖的物理方法,可有效增强病毒的传播,其中牛鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachieitis virus,IBRV）和牛肾细胞（Madin-Darby Bovine Kidney,MDBK）分别被用作模型所需病毒和细胞系。CAP被证明与病毒感染具有协同作用,可以在G2/M期阻止宿主细胞分裂增殖,降低细胞膜电位,增加细胞内钙离子水平并诱导细胞选择性自噬。通过检测免疫相关蛋白表达,CAP被证明可以抑制病毒触发的免疫原性信号传导。综上所述,我们证明了CAP触发了宿主资源对病毒繁殖的最大化,这有利于病毒疫苗的生产,并为在医疗和卫生领域应用CAP开辟了新的可能。     

孔雀传染性喉气管炎的血液细胞分析

本文对13只传染性喉气管炎(ILT)发病孔雀和9只正常健康孔雀做了血液细胞分析和比较,结果表明ILT孔雀的WBC总数、LYM的百分数高于正常健康孔雀,而RBC总数、HGB、MCH、PLT和MID、GRA的百分数均低于后者,特别是PLT呈极显著差异,为科学认识和临床诊断该病提供了重要依据。     

靶向山羊痘病毒DNA聚合酶基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

本研究针对山羊痘病毒基因组高度保守的DNA聚合酶区段,选取了5个干扰靶位点。根据RNAi技术原理,构建了包括对照在内的6个shRNA重组表达质粒,转染细胞后接种病毒,通过细胞毒液的TCID_(50)测定和用实时荧光定量PCR检测siRNA重组质粒对羊痘病毒DNA聚合酶基因表达的抑制作用。结果显示,重组表达质粒组的抑制率在63%以上,其中以pSI-W2最为明显,抑制率为93.8%。该研究应用RNAi技术在细胞水平筛选出了能够高效抑制山羊痘病毒增殖的干扰片段,为抗山羊痘病毒转基因羊的研究奠定了基础。     

细胞骨架与疱疹病毒的释放

用光镜和整装细胞电镜术对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染的牛肾组培细胞进行了观察,发现了一种未曾报道过的病毒释放方式:成熟的病毒通过一种结构连结于宿主的细胞质微丝束上(这些微丝束在整个病毒繁殖过程中没有明显变化),随着细胞病变,细胞质向中心圆缩,而微丝束并不收缩,被留在胞外,附着于其上的病毒即通过这种方式大量释放出来。     

细胞松驰素B对牛传染性鼻气管炎病毒感染与复制的影响

体外培养的牛肾细胞,经浓度为50μg/ml的细胞松弛素B(CB)处理2小时后,牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)仍能侵入细胞,繁殖的子代病毒数量不受影响。然而当同样浓度的CB在病毒的整个繁殖期中持续存在时,病毒的繁殖即完全被抑制。说明细胞的吞噬作用至少不是这种病毒进入细胞的唯一方式,可能病毒囊膜与细胞膜的融合是病毒进入细胞的主要方式;而在侵入细胞后的病毒繁殖过程中,细胞微丝和其它对CB敏感的系统起着不可缺少的作用。降解微丝对IBRV的早期发生有明显的影响,其效应强度与CB的浓度有关。还观察到CB处理对病毒形态发生方式有明显影响。     

Study of neutralizing monoclonal antibodies to bovine herpes virus Type-1 (Cooper strain) by immunoperoxidase and immunoelectron microscopy

Abstract Three neutralizing monoclonal antibodies (mAbs) that are specific against bovine herpes virus Type-1 (BHV-1) were studied as to their viral specificity by immunoperoxidase and immunoelectron microscopy. Microscopic examination of GBK BHV-1 infected cells revealed peroxidase activity represented by red-brown granular deposits in the nucleus and cytoplasm. No immunoperoxidase activity was observed in negative controls. For the ultrastructural observations, two approaches were used. Firstly we tested a pre-embedding technique using GBK infected cells, mAbs and gold conjugated-protein A. Gold particles were observed linked to the viral envelopes and to the host cell membrane. Alternatively, a second technique employed BHV-1 purified by potassium tartrate gradients, mAbs and gold conjugated-protein A. After performing the immune reaction, the samples were adsorbed to formvar-coated grids, stained with phosphotungstic acid and observed in a transmission electron microscope. Gold particles were mainly attached to the virion envelope.     

Stem Cell Research: A Novel Boulevard towards Improved Bovine Mastitis Management

The dairy industry is a multi-billion dollar industry catering the nutritional needs of all age groups globally through the supply of milk. Clinical mastitis has a severe impact on udder tissue and is also an animal welfare issue. Moreover, it significantly reduces animal value and milk production. Mammary tissue damage reduces the number and activity of epithelial cells and consequently contributes to decreased milk production. The high incidence, low cure rate of this highly economic and sometimes deadly disease is an alarming for dairy sector as well as policy makers. Bovine mammary epithelial cells (MECs) and their stem cells are very important in milk production and bioengineering. The adult mammary epithelium consists of two main cell types; an inner layer of luminal epithelial cells, which produce the milk during lactation, and an outer layer of myoepithelial cells resting on a basement membrane, which are responsible for pushing the milk through the ductal network to the teat cistern. Inner layer of columner/luminal cells of bovine MECs, is characterized by cytokeratin18, 19 (CK18, CK19) and outer layer such as myoepithelial cells which are characterized by CK14, α-smooth muscle actin (α-SMA) and p63. Much work has been done in mouse and human, on mammary gland stem cell research, particularly in cancer therapy, but stem cell research in bovine is still in its infancy. Such stem/progenitor cell discoveries in human and mouse mammary gland bring some hope for application in bovines. These progenitors may be therapeutically adopted to correct the structural/cytological defects in the bovine udder due to mastitis. In the present review we focused on various kinds of stem/progenitor cells which can have therapeutic utility and their possibilities to use as a potential stem cell therapy in the management of bovine post-mastitis damage in orders to restore milk production. The possibilities of bovine mammary stem cell therapy offers significant potential for regeneration of tissues that can potentially replace/repair diseased and damaged tissue through differentiation into epithelial, myoepithelial and/or cuboidal/columnar cells in the udder with minimal risk of rejection and side effects.     

牛肝提取物提高仔鸡免疫力的研究

将牛肝提取物注射到第13日龄和第15日龄鸡胚中能显著提高孵出后仔鸡的抗SRBC血清抗体的效价,促进脾和法氏囊淋巴细胞增殖、分化。同时,牛肝提取物与雏鸡法氏囊粗提取液,抗鸡法氏囊病毒抗体均有增强仔鸡抵抗传染性法氏囊病的能力。实验结果表明牛肝提取物中可能含有类似法氏囊素的物质。     

猪传染性水泡病病毒在去核细胞内的复制

本实验利用CB去核技术制备了IBRS-2细胞的胞质体,研究了SVDV在胞质体内的复制与发生。运用显微自显影,单个去核细胞定位包埋及其电镜自显影以及液体闪烁计数技术等综合方法,证实SVDV可在去核的细胞内复制病毒的RNA,而且可致细胞病变,并用细胞显微操作技术直接证实胞质体内可以产生有感染性的子代病毒,从而说明SVDV可利用胞质体作为活试管进行复制,无需细胞核直接参加调控。     

利用人摄金蛋白(METALLOTHIONEIN)启动子和牛乳突瘤病毒在哺乳动物细胞中表达乙型肝炎表面抗原

用人Metallothioenin-Ⅱ启动子、乙型肝炎表面抗原基因,SV40早期基因的编接位点和多聚A位点构成了表达组件,然后插入到经改造过的BpV-1质粒中。所得质粒pdMTsAg-5转染小鼠C127细胞得到转化克隆。Ausria Ⅱ检测证明13株中有12株能产生HBsAg。对其中一株进行HBsAg收率观察,隔天收获为292.6～525.8μg/升,每天收获为200.9～369.0μg/升,可连续收获60天以上。经重金属离子诱导后,收率增至583～854.4μg/升。培养液经超滤浓缩和两次密梯离心后,可集中为一个狭窄的峰,顶峰的Ausria Ⅱ cpm为1.05×10~7,密度为1.20g/ml。     

发酵法开发甲醇蛋白的研究

通过大量实验从土壤中分离筛选出1株同化甲醇能力较强的菌株15357,该菌能以甲醇作为碳源进行单细胞蛋白的发酵.甲醇蛋白得率为41.5%,粗蛋白含量为80.9%,各类氨基酸齐全,8种主要氨基酸含量丰富.毒性试验证明是一种安全的饲料添加剂,喂养蛋鸡应用试验表明,可代替鱼粉,产蛋率有明显提高.     

细胞固定化载体比表面的测定

为了衡量细胞固定化载体的性能。基于单分子层吸附理论,利用溶液中亚甲蓝染料在固形物表面的吸附倾向;建立了用于测定细胞固定化载体比表面的“动态染料吸附法”,方法学考察时以PVA-海藻酸钠的混合载体为例,结果表明四批次测量同一载体比表面的结果变异系数为5.5%,测量的载体比表面能精确反映载体内PVA,或是海藻酸钠浓度的变化,说明方法重复性好,灵敏度高,同时讨论了文献中“染料吸附法”测定比表面的不足。