一种新的B链C端去四肽胰岛素的研制方法

报道了将单体胰岛素前体(MIP)经胰蛋白酶和羧肽酶B两步连续酶切获得B链C端去四肽胰岛素(DTI)的方法。MIP由甲醇酵母表达,最高发酵表达量达到150mg/L。发酵液中MIP通过疏水层析,分子筛初步纯化后直接进行酶切,在胰蛋白酶酶切3h后加入抑制剂paminobenzamidine处理15min,然后直接加入羧肽酶B酶切6h,再通过反相柱纯化即可得到纯品DTI,从分子筛到最后DTI,总纯化得率达到77%。按中国药典小白鼠惊厥法测定得DTI的生物活力为22IU/mg,是胰岛素的80%,在Superdex G-75分子筛上测定DTI的解离聚合曲线,证明其是单体。     

去B链羧端三肽人胰岛素的分离纯化及其性质研究

将去Ｂ链羧端三肽人胰岛素原基因克隆到表达质粒ｐＢＶ２２０上,在大肠杆菌系统中经温度诱导表达,表达产物占细胞总蛋白量的１２％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到去Ｂ链羧端三肽人胰岛素,其纯度达９３％,其氨基酸组成与预期值相符,但其受体结合活性仅是标准猪胰岛素的４５％．     

B链C端去七肽(B24～B30)胰岛素的分子置换法

一个几近失活的胰岛素类似物———B链C端去七肽 (B2 4～B30 )胰岛素(DHPI)已被结晶 .该晶体属于空间群P2 ₁2 ₁2 ₁,晶胞的 1个独立区内包含有 2个DHPI分子 .应用分子置换法确定了DHPI分子在晶胞中的取向和位置 ,并在 0 .3nm分辨率水平上构建了结构模型 .研究结果表明 ,一个独立区内的 2个DHPI单体分子由一个非晶体学 2次轴联系着 ,该局部 2次轴近似平行于晶体学c轴 .这一特性直接影响了自身旋转函数对该局部对称轴取向的确定     

B链氨端去－肽（B1）羧端去五肽（B26—30）猪胰岛素的初步晶体学研究

应用悬滴气相扩散法在含６％氯化钠和１２．５％丙酮的柠檬酸缓冲体系中,获得可供Ｘ射线结构分析用的Ｂ链氨端去－肽（Ｂ１）羧端去五肽（Ｂ２６－３０）猪胰岛素单晶体。晶体属四方晶系,空间群为Ｐ４１２２或Ｐ４３２２,晶胞参数为：ａ＝ｂ＝３６．０Ａ,ｃ＝１２０．０Ａ,α＝β＝γ＝９０度。单位晶胞中每个结晶学不对称单位含有２个ＤｅｓＢ１－ＤＰＩ分子。     

去B链羧端七肽人胰岛素的分离纯化及性质研究

在大肠杆菌温度诱导体系中以非融合方式进行去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原基因的表达,获得去Ｂ链羧端七肽人胰岛素原,表达产物占细胞总蛋白量的１３％,表达产物经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析分离及胰蛋白酶和羧肽酶Ｂ的酶促转化等步骤,可得到纯度达９４％以上的去Ｂ链羧端七肽人胰岛素,其氨基酸组成与预期值相符,受体活性是标准猪胰岛素的１％．     

[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去β链C端五肽胰岛素的合成和性质

本文报道了[B10,22-Asp,B25-Tyr-NH2]-去B链羧端五肽胰岛素的制备及其生物活性。结果表明,这一类似物的生物活力比去五肽胰岛素(DPI)的活力高一倍,但却比Gerald所报道的[B10-Asp,B25-Tyr-NH_2]-DPI的活力低很多,说明后者的高活性可能依赖于分子中B22-Arg的存在。     

2.2埃分辨率B链N端去三肽猪胰岛素(DesB1-3INS)的晶体结构研究

应用同晶差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术和立体化学制约最小二乘精化技术,测定了２．２Ａ。分辨率ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ的晶体结构。晶体属于Ｒ３空间群。精化后的结构模型最终Ｒ因子为０．１７８,同标准键长、键角的均方根偏差分别为０．０１７Ａ。和２．９９°。从电子密度图与模型的拟合来看,独立区内两个分子Ｂ链Ｎ端残基的表现十分清晰,相对于三方二锌猪胰岛素的两个分子,ＤｅｓＢ１－３ＩＮＳ分子Ｉ中Ｂ链Ｎ端的构象发生了变化     

〔B25－Trp〕去B链C端五肽胰岛素酰胺的合成及性质

去Ｂ链Ｃ端八肽胰岛素（ＤＯＩ）与Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－ＮＨ２通过胰蛋白酶催化缩合后,经分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的Ｂ２５－Ｔｒｐ取代的去Ｂ链Ｃ端五肽胰岛素酰胺（〔Ｂ２５－Ｔｒｙ〕ＤＰＩ－ＮＨ２）．酶促缩合率大于８５％,回收率为３６．２％。用小白鼠惊厥法测得〔Ｂ２５－Ｔｒｐ〕ＤＰＩ－ＮＨ２的体内活力约为天然胰岛素的７０％,用人胎盘细胞膜测得的其胰岛素受体结合能力为天然胰岛素的７２．５±２．４％;利用色氨酸和酪氨酸的内源荧光研究了此类似物的溶液构象．     

Expression of monomeric insulin precursor in Pichia pastoris and its conversion into monomeric B27 Lys destripeptide insulin by tryptic hydrolysis

Monomeric B27 Lys destripeptide insulin (B27 Lys DTrI) was designed and produced from its precursor expressed in Pichia pastoris through tryptic hydrolysis instead of the less efficient tryptic transpeptidation. The monomeric B27 Lys DTrI precursor (MIP) was purified from a cultured medium of P. pastoris by a combination of hydrophobic, size-exclusion, and ion-exchange chromatography. The purified MIP was converted, by tryptic hydrolysis, to B27 Lys DTrI, which was then purified by ion-exchange chromatography to homogeneity as assessed by native gel electrophoresis, HPLC, amino acid composition,and electrospray mass-spectrometric analysis. B27 Lys DTrI exhibited superior monomeric properties in size-exclusion chromatography. The yield of MIP was 200 mg per liter of culture, and the overall yield of purified B27 Lys DTrI from the crude MIP was 70%. The in vivo biological activity of B27 Lys DTrI as determined by the mouse convulsion assay was 21 U/mg, identical to that obtained by semisynthesis.     

一种重组抗胰蛋白酶单体人胰岛素突变体的设计、制备和鉴定

用缺口双链DNA的定向突变方法分别将胰岛素前体中B链第 2 2、2 8、2 9和 3 0位改变为Asp、Lys、Pro和Lys,酵母分泌表达的前体经胰蛋白酶直接酶切 ,得到重组 [B2 2Asp、B2 8Lys、B2 9Pro、B3 0Lys]人胰岛素。它与受体的结合能力约为猪胰岛素的 6% ,而体内生物活力保留 5 0 %。通过FPLC分子筛测定其自身结合能力 ,在生理条件下浓度达 10 -4mol/L时它以单体形式存在。作为可抗胰蛋白酶酶解的单体胰岛素类似物 ,它可能具有一定的应用前景     

一种人胰岛素类似物的制备、鉴定与活性研究

采用PCR方法,将人胰岛素分子B链B10位His突变为Glu,在B25和B26位之间插入Glu,构建了［B10 Glu,B25-Glu-B26］胰岛素原融合蛋白基因.利用通用型质粒pBV220构建表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白为包含体形式,约占菌体总蛋白的20%～30%.经过复性、凝胶过滤等步骤得到胰岛素原融合蛋白.用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,经过DEAE离子交换和RP-HPLC纯化得到胰岛素突变体类似物,并经过质谱测定鉴定.凝胶过滤法测定了蛋白质分子自身的缔合性质,圆二色谱（CD）测定了构象的变化.并分别测定了放免活性、受体结合活性及小白鼠低血糖惊厥实验.结果表明,突变体分子缔合性明显下降.放免活性和受体结合活性分别约为标准胰岛素的63.5%和114.4%, 整体活力略高于天然胰岛素.     

重组人胰岛素样生长因子1的原核可溶性表达及活性鉴定

目的:原核可溶性表达人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)并进行生物活性测定。方法:PCR扩增hIGF-1核酸序列,克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,对融合蛋白DsbC-hIGF-1分别进行酶切、Western印迹和生物活性测定。结果:融合蛋白DsbC-hIGF-1在原核系统内经IPTG诱导,主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白量的30%～35%,Western印迹和MTT法测定结果证明重组DsbC-hIGF-1蛋白具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。结论:融合蛋白DsbC-hIGF在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在并具有类似天然hIGF-1的生物活性,这对进一步研究hIGF-1的结构和功能,开发相应的基因工程产品具有重要意义。     

B22 Glu Des-B30 Insulin： A Novel Monomeric Insulin

Studies on monomeric insulin with reduced self-association are important in the development of insulin pharmaceutical preparations with rapid hypoglycemic action on patients with diabetes. Here we report a novel monomeric insulin, B22 Glu des-B30 insulin, prepared from a single chain insulin precursor with B22 Arg mutated to Glu, which was expressed in Pichia pastoris and converted to B22 Glu des-B30 insulin by tryptic digestion. It still retains 50% of the in vivo biological activity of porcine insulin and does not form a dimer even at a concentration of 10 mg/ml, showing that B22 Glu plays a key role in reducing the self- association of the insulin molecule without greatly reducing its biological activity. This novel monomeric insulin might have potential applications in the clinic.     

胰岛素蛋白质工程：高活性［B10Asp］人胰岛素

用基因定位突变方法将胰岛素Ｂ链第１０位的Ｈｉｓ变为Ａｓｐ,获得高活力胰岛素──［Ｂ１０Ａｓｐ］人胰岛素。其受体结合能力和离体生物活力分别为猪胰岛素的２６２％和２３５％;体内生物活力也明显高于猪胰岛素;它的促细胞生长能力为猪胰岛素的１７４％。     

Met-Lys-双C肽人胰岛素原基因的构建表达及分离纯化

应用 Ｐ Ｃ Ｒ 定点突变方法构建编码 Ｍ ｅｔ Ｌｙｓ 双 Ｃ 肽人胰岛素原基因,并在大肠杆菌中以包含体方式获得表达 表达产物经还原、重组、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ ７５ 分离纯化,获得 Ｍ ｅｔ Ｌｙｓ 双 Ｃ 肽人胰岛素原,经胰蛋白酶与羧肽酶 Ｂ的酶解, Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔ Ｍ Ｑ 阴离子交换柱层析分离制备得人胰岛素,其放免活性、受体结合活性均与猪胰岛素相同      

Protein engineering of insulin: Two novel fast-acting insulins [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin

Blood glucose lowering assay proved that [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin exhibit potency of acute blood glucose lowering in normal pigs, which demonstrates that they are fast- acting insulin. Single-chain precursor of [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin is [B16Ala]PIP and [B26Ala]PIP, respectively, which are suitable for gene expression. Secretory expression level of the precursors in methylotrophic yeast Pichia pastoris was quite high, 650 mg/L and 130 mg/L, respectively. In vivo biological assay showed that the two fast-acting insulins have full or nearly full biological activity. So both [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin can be well developed as fast-acting insulin for clinic use.     

［B1－Ala，B2－Ala］－胰岛素：受体结合特性及生物活力研究

本文报道了［Ｂ１～Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合的特性和体外生物活力,并与胰岛素进行比较。在３７℃和杆菌肽存在下,１２５Ｉ－［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素和１２５Ｉ－胰岛素与人胎盘细胞膜作用依赖于反应时间,反应６分钟到达平衡,此时,［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素和胰岛素与胰岛素受体的最大结合分别为每毫克膜蛋白结合６．４４ｆｍｏｌ和３．４７ｆｍｏｌ：达到平衡一半所需时间（Ｔ１／２）分别为１９秒和２５秒。用１２５Ｉ－［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素作为放射配体进行竞争性结合研究,从ＩＣ（５０）得［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］胰岛素的受体结合活力为胰岛素的１３９．６％。Ｓｃａｔｏｈａｒｄ分析求得;［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素与高亲和和低亲和结合位点的结合常数在４℃时分别为５．８８×１０８Ｌ／ｍｏｌ和７．６３×１０５Ｌ／ｍｏｌ,而胰岛素分别为４．８３×１０８Ｌ／ｍｏｌ和３．３９×１０５Ｌ／ｍｏｌ。促脂肪细胞生成脂的实验表明：［Ｂ１－Ａｌａ,Ｂ２－Ａｌａ］－胰岛素的活力为胰岛素的１３０％。